【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及3-氨基-2，6-哌啶二酮的酶法合成方法和其产生酶的应用。
技术介绍
1、3-氨基-2，6-哌啶二酮(3-amino-2，6-piperidinedione，pd)是重要药物沙利度胺(thalidomide，thd)及其类似物的主要药效基团，也是其合成途径的关键中间体，因此3-氨基-2，6-哌啶二酮的合成一直是沙利度胺及其类似物(来那度胺、泊马度胺)药物合成的关键。
2、沙利度胺最初是在1957年由德国制药公司chemie-grunenthal研制，并作为镇静剂和止痛剂广泛使用。但随后由于发现其致畸性可导致新生儿多处组织器官发育不全，而被大规模禁用，后续的研究显示所使用的沙利度胺是外消旋体，而沙利度胺可以在体内被水解为(-)-n-甲酰谷氨酰胺和(-)-n-甲酰谷氨酸，这两种化合物具有很强的致畸性，可导致小脑(cereblon，crbn)蛋白结合蛋白cd147的降解。但沙利度胺药理的相关研究并没有停止，后来陆续发现沙利度胺的其他重要功能，s构型的沙利度胺及其类似物可调节t细胞并抑制其增殖，发挥免疫调节作用；通过激活自然杀伤 (natural killer)细胞，促进肿瘤细胞的凋亡，临床主要用于治疗多发性骨髓瘤，此外还有临床研究发现沙利度胺及其类似物可以抑制肿瘤坏死因子(tnf-α)释放，抑制hiv-1 病毒复制、血管生成等。沙利度胺及其类似物目前的总市值已达到200亿美元，已经成为一类极为重要的一线抗肿瘤药物和免疫调节剂。目前已经确认单一s构型的沙利度胺及其类似物能够与已发现的靶点接合，而r
3、目前合成沙利度胺及其类似物中间体3-氨基-2，6-哌啶二酮的方法一般为化学合成法，未有过生物合成方法的报道，而化学合成方法通常反应条件极端，需要高温或稀有金属作为催化剂，并且难以维持化合物手性，还需要多步的保护和脱保护，涉及到大量的保护试剂使用，污染和浪费较大，而使用生物合成的方法可以以简单的原料大量制得沙利度胺及其类似物的药物前体，符合绿色化学的要求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供3-氨基-2，6-哌啶二酮的酶法合成方法和其产生酶的应用。
2、本专利技术提供了一种蛋白质，所述蛋白质是对谷氨酰胺蓝靛素合成酶进行突变，使所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氧化结构域失活得到的蛋白质，所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、可选地，根据上述的蛋白质，所述蛋白质为下述a)或b)：
4、a)所述蛋白质的氨基酸序列与所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氨基酸序列相比，进行了第539位精氨酸残基和/或第598位赖氨酸残基突变；
5、b)所述蛋白质为将a)所示蛋白质的氨基酸序列末端添加蛋白标签序列所获得的蛋白质。
6、可选地，根据上述的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列与所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氨基酸序列相比，第539位精氨酸残基突变为丙氨酸残基和/或第598位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基。
7、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
8、上述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
9、本专利技术还提供了与上述的蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为b1)至b8) 中的任一种：
10、b1)编码上述蛋白质的核酸分子；
11、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
12、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；
13、b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；
14、b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；
15、b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；
16、b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；
17、b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物。
18、可选地，根据上述的生物材料，b1)所述的核酸分子的核苷酸序列为如下至少一种所示：
19、b11)将谷氨酰胺蓝靛素合成酶基因序列第1615-1617位的cgc替换为gca，其它核苷酸不变；
20、b12)将所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶基因序列第1792-1794位的aag替换为gca，其它核苷酸不变；
21、所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶基因序列如seq id no.1所示。
22、上述的蛋白质、上述的生物材料、谷氨酰胺蓝靛素合成酶及其同源蛋白或谷氨酰胺蓝靛素合成酶基因在如下任一中的应用：
23、(1)合成3-氨基-2，6-哌啶二酮；
24、(2)合成沙利度胺及其类似物药物。
25、所述3-氨基-2，6-哌啶二酮可为s-3-氨基-2，6-哌啶二酮。所述沙利度胺及其类似物可为沙利度胺、来那度胺、泊马度胺。
26、本专利技术还提供了3-氨基-2，6-哌啶二酮的酶法合成方法，包括采用上述的蛋白质作为催化剂，催化l-谷氨酸合成3-氨基-2，6-哌啶二酮。
27、可选地，根据上述的方法，上述的蛋白质采用琼脂糖包埋法固定。
28、本专利技术还提供了化学酶法级联一锅合成度胺类药物的方法，包括
29、(1)采用上述的方法和成3-氨基-2，6-哌啶二酮，
30、(2)采用所述3-氨基-2，6-哌啶二酮和邻苯二甲酸酐反应合成度胺类药物。
31、可选地，根据上述的方法，步骤(2)包括采用所述3-氨基-2，6-哌啶二酮和邻苯二甲酸酐在冰醋酸中反应合成沙利度胺。
32、本专利技术实施例利用谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氧化结构域突变的蛋白，经过生物酶催化法合成度胺类药物前体和重要药效基团s-3-氨基-2，6-哌啶二酮。在此基础上构建了一条化学酶法级联一锅合成度胺类药物的方法。
33、本专利技术实施例中，首次得到了谷氨酰胺蓝靛素合成途径的中间体s-3-氨基-2，6-哌啶二酮，利用谷氨酰胺蓝靛素合成酶和其同源蛋白获得谷氨酰胺蓝靛素生物合成中间体s-3-氨基-2，6-哌啶二酮的方法。
34、本专利技术实施例中，使用了点突变的方法使谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氧化结构域失活，获得可以催化产生s-3-氨基-2，6-哌啶二酮的蛋白突变体。通过构建谷氨酰胺蓝靛素合成酶及其同源蛋白氧化结构域失活的蛋白突变体进而阻断其生物合成途径获得中间体的其他方法。
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1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质是对谷氨酰胺蓝靛素合成酶进行突变，使所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氧化结构域失活得到的蛋白质，所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为下述A)或B)：
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列与所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氨基酸序列相比，第539位精氨酸残基突变为丙氨酸残基和/或第598位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基。
4.与权利要求1-3任一所述的蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为B1)至B8)中的任一种：
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：B1)所述的核酸分子的核苷酸序列为如下至少一种所示：
6.权利要求1-3任一所述的蛋白质、权利要求4或5所述的生物材料、谷氨酰胺蓝靛素合成酶及其同源蛋白或谷氨酰胺蓝靛素合成酶基因在如下任一中的应用：
7.3-氨基-2，6-哌啶二酮的酶法合成方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一所述的蛋白质作为催化剂，催化
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求1-3任一所述的蛋白质采用琼脂糖包埋法固定。
9.化学酶法级联一锅合成度胺类药物的方法，其特征在于：包括
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(2)包括采用所述3-氨基-2，6-哌啶二酮和邻苯二甲酸酐在冰醋酸中反应合成沙利度胺。
...【技术特征摘要】
1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质是对谷氨酰胺蓝靛素合成酶进行突变，使所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氧化结构域失活得到的蛋白质，所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为下述a)或b)：
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列与所述谷氨酰胺蓝靛素合成酶的氨基酸序列相比，第539位精氨酸残基突变为丙氨酸残基和/或第598位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基。
4.与权利要求1-3任一所述的蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为b1)至b8)中的任一种：
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：b1)所述的核酸分子的核...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈义华，张志龙，李鹏伟，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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