生产阿维菌素的工程菌及构建方法与应用技术

技术编号：39964160 阅读：6 留言：0更新日期：2024-01-09 00:16

本发明专利技术公开了生产阿维菌素的工程菌及构建方法与应用，其构建方法为：以阿维链霉菌ATCC31267基因组DNA为模板，PCR扩增获得SAV5063基因的上、下游同源臂片段；利用重叠延伸PCR连接成重组片段，得到缺失了SAV5063基因的线性化片段；构建线性pKCas9dO片段；将两个片段连接，构建缺失SAV5063基因的重组载体；转化到大肠杆菌ET12567，进行重组载体去甲基化，筛选，得到阳性克隆；与阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267菌丝体进行结合转移，所得转化子经PCR验证成功后即为生产阿维菌素的工程菌。本发明专利技术工程菌发酵生产阿维菌素，与野生型菌株相比，阿维菌素B1a产量提高58.68％。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，尤其涉及一种生产阿维菌素的工程菌及构建方法与应用。

技术介绍

1、阿维菌素是十六元大环内酯类抗生素，主要由八个组分构成，包括a1a、a2a、b1a、b2a四种主要组分和a1b、a2b、b1b、b2b四种次要组分。阿维链霉菌产生的阿维菌素及其衍生物具有高效低毒的抗虫活性，在农业、畜牧业和医药领域有着广泛的应用。近年来，越来越多的研究表明，阿维菌素类化合物不仅仅具有抗虫活性，在抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒方面也具有不错的效果。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维菌素的产量，降低其生产成本，提高其实际应用，进一步开发具有更好生物活性的阿维菌素类化合物具有很好的应用前景和实际应用价值。

技术实现思路

1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供生产阿维菌素的工程菌。

2、本专利技术的第二个目的是提供生产阿维菌素的工程菌的构建方法。

3、本专利技术的第三个目的是提供生产阿维菌素的工程菌发酵生产阿维菌素的应用。

4、生产阿维菌素的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

5、1)以阿维链霉菌atcc31267基因组dna为模板，以left-f与left-r为上、下游引物，进行pcr扩增获得sav5063基因的上游同源臂片段，以right-f与right-r为上、下游引物，进行pcr扩增获得sav5063基因的下游同源臂片段；

6、2)将步骤1)获得的所述上游同源臂片段和下游同源臂片段电泳回收后，利用重叠延伸pcr

7、3)以pkcas9do质粒作为出发载体，以pkc-f1与pkc-r1为上、下游引物，进行pcr扩增，纯化回收后得到片段1；以pkcas9do质粒作为出发载体，以pkc-f2与pkc-r2为上、下游引物，进行pcr扩增，纯化回收后得到片段2；

8、4)将步骤2)获得的缺失了sav5063基因的线性化片段与步骤3)获得的片段1和片段2，用无缝克隆试剂盒融合连接，构建缺失sav5063基因的重组载体(pkcd5063)；

9、5)将步骤4)获得的所述重组载体转化到大肠杆菌et12567，进行重组载体去甲基化，用含有安普霉素的lb培养基培养筛选，得到阳性克隆；

10、6)将步骤5)中获得的阳性克隆与阿维链霉菌野生型菌株atcc31267菌丝体进行结合转移，所得转化子经pcr验证成功后即为生产阿维菌素的工程菌。

11、所述sav5063基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

12、所述left-f的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述left-r核苷酸序列如seq idno.3所示；所述right-f的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述right-r的核苷酸序列如seq id no.5所示。

13、所述pkc-f1的核苷酸序列如seq id no.6所示；pkc-r1的核苷酸序列如seq idno.7所示；pkc-f2的核苷酸序列如seq id no.8所示；pkc-r2的核苷酸序列如seq id no.9所示。

14、上述构建方法构建的生产阿维菌素的工程菌。

15、上述生产阿维菌素的工程菌发酵生产阿维菌素的应用。

16、本专利技术的优点：

17、本专利技术的生产阿维菌素的工程菌发酵生产阿维菌素，与阿维链霉菌野生型菌株相比，其阿维菌素b1a的产量提高了约58.68％。

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【技术保护点】

1.生产阿维菌素的工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的生产阿维菌素的工程菌的构建方法，其特征是所述SAV5063基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的生产阿维菌素的工程菌的构建方法，其特征是所述Left-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Left-R核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Right-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述Right-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的生产阿维菌素的工程菌的构建方法，其特征是所述pKC-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；pKC-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；pKC-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；pKC-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

5.权利要求1-4之一的构建方法构建的生产阿维菌素的工程菌。

6.权利要求5所述的生产阿维菌素的工程菌发酵生产阿维菌素的应用。

【技术特征摘要】

1.生产阿维菌素的工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的生产阿维菌素的工程菌的构建方法，其特征是所述sav5063基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的生产阿维菌素的工程菌的构建方法，其特征是所述left-f的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述left-r核苷酸序列如seq id no.3所示；所述right-f的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述right-r的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，李悦，田锦平，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：

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