【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种琼三糖的制备方法，属于琼胶寡糖制备领域。
技术介绍
1、琼脂是红藻细胞壁中的一种胶状多糖，由离子性的硫琼胶和中性的琼脂糖组成。前者主要由一系列复杂多聚糖链组成，后者则是一种具有交替β-1,4-和α-1,3-糖苷键的链状线性糖，是琼胶形成凝胶状态的主要成分。琼胶寡糖源于琼脂糖，一般是指由琼胶多糖经水解后形成的聚合度为2～10的低聚糖，可根据非还原端的不同可分为琼寡糖和新琼寡糖。大量研究表明，琼胶寡糖因其具有抗炎、保肝、益生元、抗氧化等多种生理活性而在食品、化妆品、制药等行业拥有广阔应用前景，但琼胶寡糖至今还没有进行产业化的生产。
2、琼胶寡糖的制备方法主要有酸降解法和生物降解法。目前，酸降解法具有可作用底物浓度高、寡糖得率高的优点，但同时存在产物不均一、寡糖活性易丧失、高温酸解能耗高等问题；另外当高温酸解琼脂时，容易出现短时处理后降温而体系粘度回升的状况。生物降解法即酶解法，采用琼胶酶对琼胶多糖糖苷键进行特异性剪切，具有反应条件易控制、产物专一性好、工艺绿色等优点，但该法可作用底物浓度相对较低、产物得率低。
技术实现思路
1、为了解决酸解法制备琼胶寡糖产物不均一、活性易丧失、高温酸解能耗高，而酶解法可作用底物浓度低，故工业上难以大批量制备功能性琼胶寡糖，故本专利技术采用最适酶解温度条件下，通过控制酸酶解条件，将琼脂先短时间酸预水解后中和再进一步酶解的方法以高效制备琼三糖。该法在有效结合酸法和酶法两者优点的同时，减小了琼脂经高温处理后降温而体系粘度回升对后
2、为解决上述至少一个问题，本专利技术使用先酸解法后酶解法水解琼脂以制备琼胶寡糖，大大提升了产物得率。同时本专利技术以琼脂为底物，盐酸为溶剂，氢氧化钠为中和剂，可有效降低工业成本。再者，本专利技术利用酶解终产物包含琼三糖的α-琼胶酶，使用温和的最适酶解温度40℃作为反应温度，通过优化底物浓度、酸预处理的盐酸浓度和酸解时间、加酶量以有效提高琼三糖得率，在简化工艺、降低能耗、保护环境等方面都更加具有优势。此外，本专利技术采用高效阴离子交换色谱仪、超高效液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪分析产物。
3、本专利技术的第一个目的是提供一种利用α-琼胶酶高效制备琼三糖的方法，包括如下步骤：
4、(1)在稀盐酸溶液中加入琼脂，混合均匀，得到混合溶液进行反应；
5、(2)取适量步骤(1)的混合溶液，用naoh进行ph调节；
6、(3)在步骤(2)的酸解中和溶液中加入α-琼胶酶粗酶液进一步反应；
7、(4)将步骤(3)得到的产物经浓缩、纯化后，用高效阴离子交换色谱仪、超高效液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪进行分析。
8、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中琼脂酸解液中的各物质质量百分比为琼脂10～20％，稀盐酸溶液90～80％，总和为100％。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
10、(1)称取琼脂，加入盐酸溶液中，在30～50℃、300～400rpm条件下搅拌10～280min，混合均匀，得到琼脂酸解溶液；
11、(2)调节步骤(1)制备得到的琼脂酸解溶液的ph至7.0～9.0，得到琼脂酸解中和液；
12、(3)将步骤(2)得到的琼脂酸解中和液置于30～50℃、150～250rpm条件下保温10～50min后，分别向其中加入α-琼胶酶粗酶液进行酶解8～24h，煮沸10～30min灭酶后得到含有琼三糖的酸酶解液。
13、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中琼脂酸解液中的盐酸浓度为0.25～3.00m。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述琼脂酸解溶液浓度为10～20％(w/w)。
15、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中所述的混合均匀是40℃、300～400rpm搅拌10～280min。
16、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述的naoh浓度为6m。
17、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)所述的α-琼胶酶为来源于catenovulummaritimum的α-aga(cm-aga)，该酶作用于琼胶的降解终产物包含琼三糖和琼五糖。
18、在本专利技术的一种实施方式中，编码所述α-琼胶酶的核苷酸序列如seq id no.1所示。
19、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)所述的α-琼胶酶cm-aga的加酶量为10～60u/g，酶解时间为8～24h。
20、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)为，采用naoh调节琼脂酸解溶液的ph至8.0，得到琼脂酸解中和液。
21、在本专利技术的一种实施方式中，所述α-琼胶酶的添加量为40～60u/g。
22、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)所述的浓缩、纯化是先经冻干后再采用superdex 30increase 10/300gl凝胶色谱柱进行纯化。
23、在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)所述的产物分析是采用高效阴离子交换色谱仪、超高效液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪进行分析。
24、在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
25、(1)称取琼脂，加入2m盐酸溶液中，在40℃、380rpm条件下搅拌40min，混合均匀，得到15％(w/w)琼脂酸解溶液；
26、(2)调节步骤(1)制备得到的琼脂酸解溶液的ph至8.0，得到琼脂酸解中和液；
27、(3)将步骤(2)得到的琼脂酸解中和液置于40℃、180rpm条件下保温30min后，分别向其中加入40u/gα-琼胶酶粗酶液进行酶解12h，煮沸15min灭酶后得到含有琼三糖的酸酶解液。
28、本专利技术的第二个目的是本专利技术所述的方法制备得到的琼三糖。
29、本专利技术的第三个目的是本专利技术所述的琼三糖在食品、化妆品和制药领域中的应用。
30、有益效果
31、本专利技术采用最适酶解温度条件下，将琼脂先短时间酸预水解后中和再进一步酶解的方法，实现了琼三糖的特异性高效制备。与酸解法制备奇数琼寡糖的方法相比，本专利技术反应条件温和、易控制，同时减小了琼脂经高温处理后降温而体系粘度回升对后续酶解的影响。与酶解法制备奇数琼寡糖的方法相比，本专利技术作用的底物浓度高，并利用酶解终产物包含琼三糖的α-琼胶酶，使得琼三糖产量明显提升，可为工业上制备功能性琼胶寡糖提供一定的理论基础，适用于食品、化妆品和制药领域。
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1.一种琼三糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述盐酸溶液的浓度为0.25M～3.00M。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述琼脂酸解溶液浓度为10～20％(w/w)。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述α-琼胶酶为来源于Catenovulummaritimum的α-AGA，编码所述α-琼胶酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)为，采用NaOH调节琼脂酸解溶液的pH至8.0，得到琼脂酸解中和液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述α-琼胶酶的添加量为10～60U/g。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述α-琼胶酶的添加量为40～60U/g。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
9.权利要求1～8任一所述的方法制备得到的琼三糖。
10.权利要求9所述的琼
...【技术特征摘要】
1.一种琼三糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述盐酸溶液的浓度为0.25m～3.00m。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述琼脂酸解溶液浓度为10～20％(w/w)。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述α-琼胶酶为来源于catenovulummaritimum的α-aga，编码所述α-琼胶酶的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5.根据权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：班宵逢，曾小凤，李兆丰，李才明，顾正彪，洪雁，程力，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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