本发明专利技术公开了一种三驱动增强型适体双模式分析ZEN的方法，属于生化分析检测技术领域。所述三驱动是指在Exo I酶切循环放大、Poly‑HRP催化放大、荧光协同放大下的增强型驱动，所述双模式是指比色和荧光信号模式。本发明专利技术首先制备磁性检测探针，然后加入ZEN和Exo I酶，哑铃型探针从磁性检测探针上释放，并且循环累积放大，GO表面吸附/淬灭的哑铃型探针被互补链DNA2解离，再进行比色检测和荧光检测。本发明专利技术的三驱动增强型适体双模式分析ZEN的方法的灵敏度比现有报道的适体传感分析方法提高4‑14倍。该分析方法简便快速、均相高效、高灵敏、双模式、应用潜力大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种三驱动增强型适体双模式分析zen的方法，属于生化分析检测。
技术介绍
1、广泛存在于农业环境中的玉米赤霉烯酮(zen)作为一种典型的真菌毒素，具有类雌激素效应，可对消化、免疫和生殖系统等造成应激性损伤，阻碍机体的生长发育。因其对食品安全和人类健康的持续性损害和严重影响而受到高度重视，世界各国及组织将zen进行了严格的限量标准。此外，农业环境中zen存在低浓度水平污染、高检出率、加工处理过程难以去除等问题现状，都为高标准的分析检测技术提出更高要求。
2、当前对于zen的分析检测，仪器分析方法是标准的检测技术，然而存在仪器设备昂贵、前处理过程复杂等限制，难以实现现场快速检测；现有的免疫快速检测试纸条和试剂盒在开发中存在抗体制备困难、稳定性差、灵敏度有待提高等技术瓶颈。
3、适配体(apt)也称适体，作为生化传感分析检测中的新型生物识别元件，具有性能稳定均一、易获得、易化学修饰、抗干扰性强等优点，然而在开发基于适体的酶联吸附分析、试纸条分析等过程中仍然存在灵敏度低的问题。因而，开发基于适体传感技术的检测方法关键的是新型信号增强技术策略的采用。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的一些不足，本专利技术提供了一种三驱动增强型适体双模式分析zen的方法，本专利技术通过三种驱动方式增强信号的高灵敏度，并且采用双模式实现检测结果的判读，为有害风险因子的简便快速检测提供技术保障和依据。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：</p>3、本专利技术首先提供一种三驱动增强型适体双模式分析zen的方法，包括如下：
4、(1)适配体及互补链的设计
5、基于生物素修饰的玉米赤酶烯酮适配体(bio-zen-apt)，根据碱基互补配对原则设计2条互补链dna。
6、所述的生物素修饰的玉米赤酶烯酮适配体(bio-zen-apt)，是5'端修饰了一个生物素的dna单核苷酸链，有40个氨基，其序列如seq id no：1所示。
7、seq id no：1(bio-zen-apt)：5'-bio-tca tct atc tat ggt aca tta cta tctgta atg tgatat g-3'；
8、所述的互补链dna包括cdna1和cdna2。
9、所述cdna1是dna单核苷酸链，有21个氨基，其中5'端修饰了一个生物素，3'端修饰了一个6-羧基荧光素，其序列如seq id no：2所示。
10、seq id no：2(cdna1)：5'-bio-taatgt acc atagat agatga-fam-3'；
11、所述cdna2是dna单核苷酸链，有21个氨基，其序列如seq id no：3所示。
12、seq id no：3(cdna2)：5'-tcatct atc tat ggt acatta-3'。
13、所述的互补链dna1(cdna1)与适配体可以互补结合，并且结合力较zen与apt弱，互补链dna2(cdna2)与cdna1可以互补结合。
14、(2)磁性检测探针制备
15、所述的磁性检测探针是将哑铃型探针中的cdna1与磁珠表面的zen-apt互补结合形成的复合物探针。
16、具体地，将bio-zen-apt修饰于链霉亲和素磁珠(sa-mbs)表面后，与哑铃型探针互补形成的磁性探针。
17、所述磁性检测探针制备包括如下步骤：
18、制备apt-mbs探针：将50-500μl的0.1-40μg ml-1sa-mbs重悬后磁分离，用tris-hcl缓冲液清洗，加入20-200μl的0.1-15μmol l-1经过降温退火后的bio-zen-apt和1ml tris-edta缓冲液，室温下振荡10-90min，通过磁分离去除上清液，用1ml tris-edta缓冲液清洗；最后，离心管中加入500μl含2％牛血清蛋白的tris-edta缓冲液重悬，在4℃下保存。
19、其中优选的，所述bio-zen-apt的浓度为5μmol l-1。
20、制备哑铃型探针：取相同体积的生物素(链霉亲和素)修饰的聚辣根过氧化物酶poly-hrp(poly-hrp-sa)与cdna1，混合均匀，在25℃条件下置于恒温混匀仪上孵育1小时，得到poly-hrp-cdna1-fam哑铃型双信号探针。
21、进一步的，所述cdna1的浓度为1-8μmol l-1，poly-hrp-sa的浓度为0.05-2ng/ml；优选的所述cdna1的浓度为6μmol l-1，poly-hrp-sa的浓度为0.2ng/ml。
22、制备磁性检测探针：取等体积的哑铃型探针与apt-mbs探针混合，在15-45℃下摇动孵育10-90min，通过磁分离获得磁性检测探针。
23、(3)exo i酶切循环信号放大(一级驱动)
24、在步骤(2)得到的磁性检测探针中加入50-500μl含有待测目标物的样品和50-500μl氧化石墨烯(go)溶液，37℃摇动孵育30min；然后在体系中加入50-500μl的exo i，在37℃下摇动孵育15min。
25、进一步的，所述加入的exo i浓度为2-25uμl-1，所述加入的go浓度为5-80μg ml-1；优选的，所述加入的exo i浓度为12uμl-1，所述氧化石墨烯溶液浓度为25μg ml-1。
26、在该步骤中，加入待测物zen与apt特异性结合形成复合物，并从检测探针上竞争释放哑铃型探针，加入go吸附poly-hrp-cdna1-fam哑铃型探针并使其荧光猝灭，加入适量exo i识别切割待测物zen与zen-apt特异性结合形成复合物释放zen继续参与反应，释放的zen再次竞争释放检测探针上的哑铃型探针，在exo i酶切循环中获得哑铃型探针信号的累积放大，实现信号的第一级驱动增强。
27、(4)解吸附与荧光恢复
28、取50-500μl步骤(3)得到的上清液(上清液中从磁性检测探针上解离出的含有poly-hrp-cdna1-fam哑铃型探针)，加入20-200μl的1-6μmol l-1cdna2溶液，37℃下振荡孵育30min，cdna2与cdna1互补结合，从go上解离，形成双链哑铃型探针，并实现荧光信号的恢复。
29、其中，优选的，所述cdna2溶液的浓度为4.5μmol l-1。
30、(5)双模式读取检测(二级/三级驱动)
31、将步骤(4)的产物分为两份，其中一份中加入50-500μl的tmb显色液，室温下反应10min，加入50-500μl的1-20mol l-1硫酸溶液终止反应，读取450nm的吸光度值；另一份中加入50-500μl稀释比例为1:500-10000的sgi(sybr green i荧光染料)，室温反应10mi本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种三驱动增强型适体双模式分析ZEN的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述可识别ZEN的适配体为生物素修饰的ZEN适配体(Bio-ZEN-Apt)，其序列如SEQ ID No：1所示：5'-Bio-TCA TCT ATCTATGGT ACA TTA CTA TCT GTA ATG TGA TAT G-3'；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中Apt-MBs探针制备过程中所述SA-MBs和适配体的用量为50-500μL：20-200μL，其中SA-MBs浓度为0.1-40μg mL-1，适配体的浓度为0.1-15μmol L-1；优选的，所述适配体的浓度为5μmol L-1；所述室温振荡反应10-90min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)制备哑铃型探针过程中，所述Poly-HRP-SA和cDNA1所用体积量相同，所述孵育为在25℃条件下孵育1小时；其中
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)制备磁性检测探针过程中，所述哑铃型双信号探针与Apt-MBs探针所用体积量相同，所述孵育反应为在15-45℃下摇动孵育10-90分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述加入的Exo I浓度为2-25UμL-1，所述氧化石墨烯溶液浓度为5-80μg mL-1；加入GO溶液后孵育反应为37℃摇动孵育30min，加入Exo I后孵育反应为37℃下摇动孵育15min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述加入的Exo I浓度为12UμL-1，所述氧化石墨烯溶液浓度为25μg mL-1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中加入的cDNA2的浓度为1-6μmolL-1，优选的，所述cDNA2的浓度为4.5μmol L-1；所述孵育为37℃下振荡孵育30min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述SGI稀释比例为1:500-10000，优选的，所述SGI稀释比例为1:2000。
10.权利要求1-9任一项所述方法在检测样品中ZEN或其含量中的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种三驱动增强型适体双模式分析zen的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述可识别zen的适配体为生物素修饰的zen适配体(bio-zen-apt)，其序列如seq id no：1所示：5'-bio-tca tct atctatggt aca tta cta tct gta atg tga tat g-3'；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中apt-mbs探针制备过程中所述sa-mbs和适配体的用量为50-500μl：20-200μl，其中sa-mbs浓度为0.1-40μg ml-1，适配体的浓度为0.1-15μmol l-1；优选的，所述适配体的浓度为5μmol l-1；所述室温振荡反应10-90min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)制备哑铃型探针过程中，所述poly-hrp-sa和cdna1所用体积量相同，所述孵育为在25℃条件下孵育1小时；其中
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)制备磁性检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：李明，滕维鹏，路文英，薛永来，杜道林，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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