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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学、分析化学和工程材料等领域,具体涉及一种新型的细胞内感染细菌的检测及杀伤方法,具体包括聚集诱导发光光敏剂以及核酸修饰的多功能噬菌体偶联物,其能够快速地进入哺乳动物细胞,特异性识别胞内感染的细菌,对其进行荧光点亮标记成像。同时,借助聚集诱导发光光敏剂的光动力活性和噬菌体本身的侵染性能,可以对细胞内细菌进行高效地协同杀伤,并恢复受感染的细胞活性。
技术介绍
1、分子结构中含有运动转子的聚集诱导发光光敏剂 (aggregation-inducedemission photosensitizers,英文简称aie pss)在良好的溶剂中溶解时,会进行低频运动。这种分子内运动通过快速非辐射途径耗散激子能量,从而使分子在溶液状态下不发出荧光或仅发出较弱的荧光。而在聚集状态下,由于分子内运动被限制,非辐射衰变通道被阻断,辐射跃迁通道开启,从而发出强烈的荧光。aie pss表现出大的stokes位移、较强的抗光漂白能力和优异的生物相容性等优点,并被广泛应用于不同层次和维度的生物分子和结构的可视化成像观察,包括生物分子特异性分析、亚细胞或细胞水平的实时成像、高分辨率组织成像、药物传递实时跟踪、成像引导的疾病治疗等复杂动态过程的研究。不仅如此,通过对分子结构的调控,aie pss 能够表现出优异的光动力活性,尤其是聚集状态下,aie pss表现出明显增强的ros产生能力,已经被应用于体内外的病原微生物、肿瘤等的诊疗研究。
2、来源于人体本身的噬菌体作为细菌的特异性病毒,可以靶向识别并定植于宿主细菌进行扩增繁殖,最终
3、球形核酸纳米结构是由经过化学修饰的颗粒制成的多价纳米结构,具有高定向寡核苷酸的致密外壳。第一批球型核酸纳米结构是使用金纳米颗粒核心制成的,但此后的核心成分包括各种无机颗粒如银,量子点,氧化铁和二氧化硅,有机材料如脂质体,聚合物,蛋白质和其他大分子,以及混合结构,甚至于中空的结构。所有的球型核酸纳米结构可以通过特定受体介导的内吞作用迅速进入细胞,而无需穿膜载体的修饰和介导。
4、细菌感染在全球范围内造成严重的疾病和居高不下的死亡率,抗生素使得无数人免于细菌感染。然而,由于抗生素的滥用,抗生素耐药性问题日益严重。更棘手的是,一些细菌能够在宿主细胞内存活和复制,并且对传统的抗生素具有高度耐药性。未完全清除的细胞内细菌甚至可以从最初的感染部位传播到其他组织,引起慢性或复发性感染。虽然免疫细胞(即巨噬细胞)通过识别、摄入和消化入侵的有害细菌来防御细菌感染,但细胞内特异性细菌的分泌系统可以使病原体在巨噬细胞中存活。在这种情况下,巨噬细胞不仅不能消灭细菌,还可能成为细菌繁殖的来源,导致肺结核、败血症、痢疾、流行性脑脊髓膜炎等严重疾病。此外,宿主巨噬细胞的屏蔽作用极大地阻碍了对细胞内细菌感染的检测和杀伤。越来越多的证据表明,细胞内细菌与恶性疾病的发生和发展密切相关。例如,肿瘤内细菌的存在对癌症治疗耐药性的产生具有潜在作用,因为它们具有将化疗药物分解成无活性代谢物的能力。细胞内致病菌感染也可引起慢性炎症,促进肿瘤的发生、发展和转移等。因此,胞内细菌感染的诊断和治疗对预防和控制细菌感染及相关疾病具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种新型的细胞内感染细菌的检测及杀伤方法,解决了目前细胞内细菌的检测及杀伤方法中靶向识别能力不足、生物相容性较差、杀菌效率偏低,不能实时动态跟踪抗菌剂对胞内细菌的识别和杀灭过程等问题。
2、为达到上述目的,本专利技术采用的第一个技术方案是:
3、一种新型的细胞内感染细菌的检测方法,包括以下步骤:
4、第一步,将核酸修饰在噬菌体表面,形成球形核酸纳米结构,然后将聚集诱导发光光敏剂(aie pss)与核酸相连,获得噬菌体偶联物;
5、第二步,将噬菌体偶联物与受宿主菌感染的细胞共培养;
6、第三步,将上述共培养体系在荧光显微镜下进行荧光成像,细胞内的宿主菌被荧光点亮标记。
7、本专利技术采用的第二个技术方案是:
8、一种新型的细胞内感染细菌的杀伤方法,包括以下步骤:
9、第一步,将核酸修饰在噬菌体表面,形成球形核酸纳米结构,然后将聚集诱导发光光敏剂(aie pss)与核酸相连,获得噬菌体偶联物;
10、第二步,将噬菌体偶联物与受宿主菌感染的细胞共培养;
11、第三步,将上述共培养体系在光源下照射,对细胞内的宿主菌杀伤。
12、上述技术方案中的有关内容解释如下:
13、1. 上述方案中,所述核酸为15个胸腺嘧啶(t)碱基,5’端被羧基修饰,选择不同长度不同碱基种类的核酸序列,或选择有无其他基团修饰的具有不同功能的核酸,都是可行的;通过噬菌体上的氨基与核酸上修饰的羧基发生共价偶联反应,在噬菌体表面连接上核酸链,使之形成核酸纳米结构。噬菌体与核酸的连接也可使用巯基与马来酰亚胺反应、炔基(包括环炔)与叠氮的点击反应等方式。其他的核酸和噬菌体连接/结合的方法,不论是化学方法,还是物理方法,能达到本技术方案技术效果的,与本技术方案同属一个专利技术思路。
14、2. 上述方案中,噬菌体偶联物所修饰的核酸链的化学组成、序列信息及序列长度不限,并且偶联物不影响噬菌本身对宿主菌的特异性侵染和靶向性能,具有稳定的生物活性、优异的光稳定性以及生物相容性。
15、3. 上述方案中,所述的聚集诱导发光光敏剂(tvp-t)为全新合成,选自以下结构式中的一种:
16、
17、其中,其中r是一个或多个可与一个或多个荧光团共轭的发色团。基于结构的任何修饰(添加一个或多个r基团),其中r是从由氢、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基-ncs、烷基-n3和烷基-nh2等基团中任意选择的。n = 1,2,3,4,5,6,7,8,9等等。选择同样具有光动力活性的其他聚集诱导发光光敏剂也是可行的。主要特征为:与噬菌体表面蛋白质中存在的精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸发生化学反应。
18、4. 上述方案中,通过静电结合作用连接将聚集诱导发光光敏剂与核酸相连。带负电荷的核酸链与合成的带正电荷的具有高效的光动力活性的聚集诱导发光光敏剂(aiepss)通过静本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型的细胞内感染细菌的检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
2.一种新型的细胞内感染细菌的杀伤方法,其特征在于:包括以下步骤:
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述核酸被羧基修饰,通过噬菌体上的氨基与核酸上修饰的羧基发生共价偶联反应将DNA修饰在噬菌体表面。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述聚集诱导发光光敏剂选自以下结构式中的一种:
5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:通过静电结合作用连接将聚集诱导发光光敏剂与核酸相连。
6. 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述噬菌体为大肠杆菌亚种(Escherichia coli-15597)的特异性病毒,或大肠杆菌不同亚种的特异性噬菌体的任意一种,或革兰氏阳性细菌的特异性噬菌体、革兰氏阴性细菌的特异性噬菌体的任意一种。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述受宿主菌感染的细胞为RAW264.7巨噬细胞,或细胞系细胞的任意一种;所述宿主菌为噬菌体相对应的宿主细菌,或选自不同噬菌体所对应的不同宿主细菌的
8.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:共培养的时间为5-120分钟。
9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:光源照射的时间为1-60分钟。
10.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述光源为白光。
...【技术特征摘要】
1.一种新型的细胞内感染细菌的检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
2.一种新型的细胞内感染细菌的杀伤方法,其特征在于:包括以下步骤:
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述核酸被羧基修饰,通过噬菌体上的氨基与核酸上修饰的羧基发生共价偶联反应将dna修饰在噬菌体表面。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述聚集诱导发光光敏剂选自以下结构式中的一种:
5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:通过静电结合作用连接将聚集诱导发光光敏剂与核酸相连。
6. 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述噬菌体为大肠杆菌亚种(escherich...
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