【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体而言，涉及一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸中的应用。
技术介绍
1、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，又称香草酸、香荚兰酸，广泛存在于自然界中，如在香荚兰豆、香子兰荚、秘鲁香膏等许多植物中均有发现，具有较强的抗氧化、抗菌活性，具有粉香、奶油香，可用于调配椰子、坚果、奶油等实用香精。
2、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的制备方法主要有提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以香荚兰豆等植物为原料，经浸提、蒸发等步骤提取获得4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，这种方法的高成本、原料来源有限、低效率限制了其工业化应用。化学合成法具有环境污染严重、产品质量低等缺点，限制了其应用范围。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。
3、目前，国内外学者报道了多种4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的生物法制备路线，中国专利cn100429317通过黑曲霉菌水解米糠油皂脚中的阿魏酸酯产生阿魏酸，并将其转化为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，发酵72h，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的浓度仅为2.24g/l。许美玲等选育一株链霉菌，能够将阿魏酸转化为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，并对其发酵转化条件进行优化，经12h转化，可将1g/l阿魏酸转化为0.261g/l的4-羟基-3-甲氧基苯甲酸。priyaupadhyay等通过菌pseudomonas putida kt2440发酵转化阿魏酸制备4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，经24h发酵，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的产量不超过
4、以上报道的4-羟基-3-甲氧基苯甲酸生物合成路线具有生产效率低，反应周期长等缺点。因此，创建一条效率高、成本低的4-羟基-3-甲氧基苯甲酸制备方法迫在眉睫。
5、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸中的应用，该重组菌同时表达扁桃酸脱氢酶(mdh)、α-酮酸脱羧酶(kdc)和乙醛脱氢酶(aldh)，通过扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶的催化，可将4-羟基-3-甲氧基扁桃酸转化为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了一种合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的重组菌，其包含编码扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶的基因；
4、其中，扁桃酸脱氢酶包括ermdh和bcmdh；ermdh的氨基酸序列如seq id no.1所示，bcmdh的氨基酸序列如seq id no.2所示；
5、α-酮酸脱羧酶包括brkdc和sakdc；brkdc的氨基酸序列如seq id no.3所示，sakdc的氨基酸序列如seq id no.4所示；
6、乙醛脱氢酶包括ttaldh和aoaldh；ttaldh的氨基酸序列如seq id no.5所示，aoaldh的氨基酸序列如seq id no.6所示。
7、本专利技术首次以4-羟基-3-甲氧基扁桃酸为底物，合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸。具体地，利用上述重组菌表达的扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶，将底物4-羟基-3-甲氧基扁桃酸依次转化为4-羟基-3-甲氧基苯乙醛酸和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛后再进一步转化为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，反应过程中所需辅酶均可由菌体代谢葡萄糖来提供。具体的合成路线如图1所示。
8、在一些实施例中，上述扁桃酸脱氢酶ermdh源自enterobacter roggenkampii，genbank编号klp24925.1，其氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.7所示。
9、在一些实施例中，上述扁桃酸脱氢酶bcmdh源自burkholderia cepacia，genbank编号kwd87456.1，其氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.8所示。
10、专利技术人在获得扁桃酸脱氢酶ermdh和bcmdh的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
11、在一些实施例中，上述α-酮酸脱羧酶brkdc源自bacillus rhizoplanae，genbank编号cag9613710.1，其氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.9所示。
12、在一些实施例中，上述α-酮酸脱羧酶sakdc源自salinispora arenicola，genbank编号gim84875.1，其氨基酸序列如seq id no.4所示，核苷酸序列如seq id no.10所示。
13、专利技术人在获得α-酮酸脱羧酶brkdc和rflta的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
14、在一些实施例中，上述乙醛脱氢酶ttaldh源自thermanaeromonas toyohensis，genbank编号smb99042.1，其氨基酸序列如seq id no.5所示，核苷酸序列如seq id no.11所示。
15、在一些实施例中，上述乙醛脱氢酶aoaldh源自azoarcus olearius，genbank编号cal95049.1，其氨基酸序列如seq id no.6所示，核苷酸序列如seq id no.12所示。
16、专利技术人在获得乙醛脱氢酶ttaldh和aoaldh的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
17、在一些实施例中，上述重组菌的构建方法为：将扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至宿主菌株中，即获得上述重组菌。
18、在一些实施例中，上述表达载体包括pacycduet-1和petduet-1。
19、在一些实施例中，上述重组菌的宿主为大肠杆菌。
20、在一些实施例中，上述大肠杆菌包括escherichia coli bl21(de3)、escherichiacoli dh5α和escherichia coli xl-blue。
21、本专利技术重组的大肠杆菌通过双质粒共表达3个酶的编码基因，可选地，pacycduet-1装载扁桃酸脱氢酶，petduet-1装载α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶，然后将两个重组质粒转化到宿主菌株，得到重组工程菌。
22、第二方面，本专利技术提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。
23、第三方面，本专利技术提供了一种核酸分子，其编码具有将4-羟基-3-甲氧基扁桃酸转化为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸功能的蛋白，上述核酸分子包括编码扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶的基因；
24、其中扁桃酸脱氢酶包括ermd本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌包含编码扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶的基因；
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌。
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将4-羟基-3-甲氧基扁桃酸转化为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸及其下游产物中的应用。
8.一种合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的方法，其特征在于，其包括将权利要求1或2所述的重组菌加入含有4-羟基-3
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系中包括：4-羟基-3-甲氧基扁桃酸1-70g/L，葡萄糖10-100g/L，重组菌体量1-20g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
...【技术特征摘要】
1.一种合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌包含编码扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶的基因；
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌。
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将4-羟基-3-甲氧基扁桃酸转化为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码扁桃酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦勇，杨波，张炜，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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