【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体而言，涉及产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌、构建方法及β-榄香烯的制备方法。
技术介绍
1、β-榄香烯(β-elemene，(1s，2s，4r)-(-)-2,4-二异丙烯基-1-甲基-1-乙烯基环己烷)是一种倍半萜类化合物，其存在于蒲公英等菊科植物中。高纯度的β-榄香烯是一种透明液体，其具有挥发性气味，可溶于烷烃等有机溶剂，几乎不溶于水。β-榄香烯具有消炎、抗氧化和抗癌等生物活性，目前已经被应用于癌症的临床治疗中。
2、目前，β-榄香烯主要通过化学合成、植物萃取、或是微生物发酵获取。化学合成手段技术路线复杂，成本高昂，且得率底下。从植物中萃取，能够得到具有生物活性的β-榄香烯，但提取率低，同时，植物的生长周期长，植物生长环境苛刻，这些因素均限制了β-榄香烯的获取。
3、通过代谢工程改造工程微生物，为β-榄香烯的生产提供了另一种方式，该方法具有原料成本低、环境污染小等优点。通过代谢工程手段改造细菌或酵母，引入异源生物合成途径，结合代谢网络优化，生产具有安全性和高生物活性的β-榄香烯。
4、解脂耶氏酵母作为一种油脂酵母，具有广泛的底物利用能力，是公认的安全性菌株。但迄今为止，利用酵母生产β-榄香烯的报道较少，且产量普遍较低，更未有在解脂耶氏酵母中合成β-榄香烯的研究报道。因此，亟需开发β-榄香烯合成的解脂耶氏酵母工程菌株。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌、构
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、本专利技术提供一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，将解脂耶氏酵母内源的hmgr基因、优化的吉马烯a合成酶hagasl101wt412sd433nw436a基因、解脂耶氏酵母内源的erg19基因、解脂耶氏酵母内源的erg13、法尼基二磷酸酯合成酶erg20的hagasl101wt412sd433nw436alerg20融合基因整合至解脂耶氏酵母中，得到所述产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌；
4、其中，所述hagasl101wt412sd433nw436alerg20融合基因如seq id no.1所示，所述优化的吉马烯a合成酶hagasl101wt412sd433nw436a基因片段的序列如seq idno.7所示。
5、进一步，包括以下步骤：
6、s1、先将所述hmgr基因导入所述解脂耶氏酵母中，得到工程菌hbsbt01-01；再将所述优化的吉马烯a合成酶hagasl101wt412sd433nw436a基因片段导入所述工程菌hbsbt01-01，得到工程菌hbsbt01-02；
7、s2、将所述erg13基因、所述erg19基因、所述hagasl101wt412sd433nw436alerg20融合基因整合到所述工程菌hbsbt01-02中，得到工程菌hbsbt01-03；
8、s3、将质粒pub4-cre转化到所述工程菌hbsbt01-12中，获得工程菌hbsbt01-13；
9、s4、将解脂耶氏酵母内源的cat2基因整合到所述工程菌hbsbt01-03中，得到解工程菌hbsbt01-04；
10、s5、将含有过氧化物酶体定位标签epts1的erg19基因、hmgr基因、erg13基因整合到所述工程菌hbsbt01-04中，得到工程菌hbsbt01-05；
11、s6、将含有过氧化物酶体定位标签epts1的erg8基因、erg12基因、idi和hagasl101wt412sd433nw436alerg20基因整合到所述工程菌hbsbt01-05中，得到工程菌sbt01-06，所述工程菌06为所述产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌。
12、进一步，所述步骤s1具体如下：
13、s1-1、将所述hmgr基因片段连接到质粒phr_a08_hrgfp中，得到质粒phr_a08_hmgr；
14、s1-2、将所述质粒phr_a08_hmgr和质粒pcrispryl_a08转化到所述解脂耶氏酵母中，获得所述工程菌hbsbt01-01；
15、s1-3、将所述优化的吉马烯a合成酶hagasl101wt412sd433nw436a基因片段连接到质粒phr_a08_hrgfp中，得到质粒phr_xpr2_hagasl101wt412sd433nw436a；
16、s1-4、将所述质粒phr_xpr2_hagasl101wt412sd433nw436a和所述质粒pcrispryl_a08转化到所述工程菌hbsbt01-01中，获得工程菌hbsbt01-02。
17、进一步，所述步骤s2具体如下：
18、s2-1、采用所述erg13基因、启动子pub8t和终止子cyc1t构建表达盒pub8t-erg13-cyc1t的序列片段，再将所述表达盒pub8t-erg13-cyc1t的序列片段连接到质粒puc19中，得到质粒puc19-pub8t-erg13-cyc1t；
19、s2-2、采用所述erg19基因、启动子pgpd和终止子xpr2t构建表达盒pgpd-erg19-xpr2t的序列片段，再将所述表达盒pgpd-erg19-xpr2t的序列片段连接到质粒puc19中，得到质粒puc19-pgpd-erg19-xpr2t；
20、s2-3、采用解脂耶氏酵母内源的启动子pfba、所述hagasl101wt412sd433nw436alerg20融合基因和终止子pex20t构建表达盒pfba-hagasl101wt412sd433nw436alerg20-pex20t的序列片段，再将所述表达盒pfba-hagasl101wt412sd433nw436alerg20-pex20t的序列片段连接到质粒puc19中，得到质粒puc19-pfba-hagasl101wt412sd433nw436alerg20-pex20t；
21、s2-4、以质粒pina1312为模板，扩增得到loxp-ura3d1-loxp；将解脂耶氏酵母rdna位点上下游同源臂、片段loxp-ura3d1-loxp无缝连接到质粒puc19中，得到质粒puc19-rdna-lul；
22、s2-5、经测序验证正确后，将所述表达盒pub8t-erg13-cyc1t、所述表达盒pgpd-erg19-xpr2t和所述表达盒pfba-hagasl101wt412sd433nw436alerg20-pex20t从对应质粒中扩增纯化后，无缝连接到所述质粒puc19-rdna-lul中，得到序列如seq id no.2所示的质粒puc19-rdna-lul-u13c-g19x-hg*lep；
23、s2-6、将所述质粒puc19-rdnalul-u13c-g19x本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，将解脂耶氏酵母内源的HMGR基因、优化的吉马烯A合成酶HaGASL101WT412SD433NW436A基因、解脂耶氏酵母内源的ERG19基因、解脂耶氏酵母内源的ERG13、法尼基二磷酸酯合成酶ERG20的HaGASL101WT412SD433NW436ALERG20融合基因整合至解脂耶氏酵母中，得到所述产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌；
2.根据权利要求1所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体如下：
4.根据权利要求3所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体如下：
5.根据权利要求4所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，所述步骤S4具体如下：
6.根据权利要求5所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，所述步骤S5和
7.根据权利要求6所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，所述步骤S5具体如下：
8.根据权利要求7所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，所述步骤S6具体如下：
9.一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌采用权利要求1-8任意一项所述的构建方法得到。
10.一种β-榄香烯的制备方法，其特征在于，采用权利要求9所述的产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌制备。
...【技术特征摘要】
1.一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，将解脂耶氏酵母内源的hmgr基因、优化的吉马烯a合成酶hagasl101wt412sd433nw436a基因、解脂耶氏酵母内源的erg19基因、解脂耶氏酵母内源的erg13、法尼基二磷酸酯合成酶erg20的hagasl101wt412sd433nw436alerg20融合基因整合至解脂耶氏酵母中，得到所述产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌；
2.根据权利要求1所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，所述步骤s1具体如下：
4.根据权利要求3所述一种产β-榄香烯的解脂耶氏酵母基因工程菌构建方法，其特征在于，所述步骤s2具体如下：
5.根据权利要求4所述...
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