【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学和分析化学的交叉领域，具体涉及一类硝基还原酶开启式半菁染料荧光探针及其制备方法、检测方法，以及该探针在临床细菌鉴定中的可视化应用。
技术介绍
1、细菌作为微生物的典型代表，对人们的生产生活和生命健康密切相关。大多数细菌对人类无害，在消化道、维生素生产和病变细胞的清除等方面发挥着重要作用。但在临床上，致病菌可能会导致严重的健康问题，如肺炎、腹泻、骨髓炎和双重感染甚至死亡。例如，世界卫生组织在2017年报告的处于“优先状态”的危害病原体eskape家族(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属细菌)，其对多种抗生素发展出了耐药机制，在医院获得性感染中此类细菌的占比逐渐增加，正成为世界范围内的一个严重问题。由于缺乏快速诊断方法来识别临床环境中的细菌病原体，导致在治疗过程中经常不必要地使用广谱抗生素。因此细菌菌株的鉴定对于细菌感染的治疗和抗生素的开发至关重要。
2、当前，临床上和生物实验室中用于鉴定细菌的方法主要有核酸扩增、蛋白/酶鉴定、基因组测序等。此外，微流控平台和许多改进的质谱分析法也正在被研究人员开发中。然而，这些方法往往都需要昂贵的仪器和复杂耗时的程序。为了克服这些局限性，研究人员转而致力于使用具有非侵入性、高灵敏度和高特异性等特性的荧光探针或纳米材料用于细菌的检测和鉴定，这使得细菌在体外和体内的实时成像和定量分析成为可能。目前，基于硝基还原酶开发细菌荧光探针被认为是一个明智之举。硝基还原酶(ntr)是一类主要存在于细菌以及古生菌和真核生物中的黄素酶家族，能
3、尽管很多硝基还原酶响应型荧光探针具有很高的灵敏度，但它们缺乏简便直观区分细菌种类的能力，这对临床上的细菌诊断和治疗具有重要意义。在这里，我们基于半菁染料结构设计并合成了硝基还原酶“开启式”荧光探针，并进一步尝试将其应用于细菌的检测和鉴定。在表观颜色上，探针对eskape家族的不同致病菌呈现出明显的差异性，并在细菌荧光成像方面也具有较大的应用潜力。据我们所知，虽然有一些纳米材料实现了某些细菌的比色鉴别，但这些工作通常聚焦于单一或者几个菌种，且纳米材料在制备和应用上并不如小分子荧光探针简便和快速。因此我们这是首次报道了使用小分子荧光探针实现了eskape家族致病菌的可视化鉴定。
技术实现思路
1、专利技术目的：为了克服现有检测技术的不足，本专利技术提供了一类硝基还原酶开启式半菁染料荧光探针的制备方法及其在可视化鉴定临床细菌中的应用。该类半菁染料荧光探针制备简便、响应灵敏、特异性强，更关键的是能够直观地、可视化地辨别不同种类的临床致病菌。
2、技术方案：为实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：
3、本专利技术的第一个专利技术目的是：提供一类硝基还原酶开启式的半菁染料荧光探针，其结构通式为：
4、
5、其中，r1、r2、r3、r4、r6、r7、r8、r9可独立地选为h、f、cl、br、i、ch3、oh、cooh、och3、sch3、so3h、no2或ph；或r1与r2、r2与r3、r3与r4、r6与r8、r7与r9相邻之间以苯环、萘环、蒽环或菲环的形式并联；
6、r5可选为ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、(ch2)2oh、(ch2)3so3-或(ch2)4so3-；
7、r10可选为苯、甲基苯、萘、甲基萘、蒽、甲基蒽、菲、甲基菲、呋喃、甲基呋喃、噻吩、甲基噻吩、吡咯、甲基吡咯、吡啶、甲基吡啶、噻唑、甲基噻唑、恶唑、甲基恶唑、咪唑、甲基咪唑、噻嗪、甲基噻嗪、嘧啶、甲基嘧啶、嘌呤或甲基嘌呤；
8、x可选为o、s、se、c、chch3或c(ch3)2；
9、y可选为cl、br、i或tso；
10、z可选为o、s、nh或ph；
11、n可选为0、1或2。
12、优选结构为：r1＝h；r2＝h；r3＝h；r4＝h；r5＝ch3或ch2ch3；r6＝h；r7＝h；r8＝h或och3；r9＝h或och3；r10＝苯或甲基苯；x＝s或c(ch3)2；y＝br或i；z＝o或s；n＝0或1。
13、更优选的，r1＝h；r2＝h；r3＝h；r4＝h；r5＝ch2ch3；r6＝h；r7＝h；r8＝och3；r9＝och3；r10＝甲基苯；x＝s；y＝i；z＝o；n＝0。
14、本专利技术的第二个专利技术目的是：提供如式i所示的半菁染料荧光探针的制备方法，合成路线如下：
15、
16、其中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、x、y、z、n的选择及优选结构同上述式i的要求；
17、a可选为cl、br或i，优选结构为br。
18、一种半菁染料荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
19、a：将含氮杂环与亲电试剂按摩尔比(0.5～4):1混合，反应温度120～190℃，反应时间4～10h；或将含氮杂环与亲电试剂按摩尔比(0.5～4):1混合，超干乙腈作溶剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h；
20、b：将芳醛类衍生物和硝基化合物按摩尔比(0.5～1):1混合，超干乙腈作溶剂，碘化钾和碳酸铯作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h；
21、c：将步骤a和步骤b制得的两类产物按摩尔比(0.5～1):1混合，超干乙腈作溶剂，三乙胺作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h；或将步骤a和步骤b制得的两类产物按摩尔比(0.5～1):1混合，无水乙醇作溶剂，无水乙酸钠作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间1～5h；或将步骤a和步骤b制得的两类产物按摩尔比(0.5～1):1混合，超干吡啶作溶剂，反应温度60～100℃，反应时间1～5h；或将步骤a和步骤b制得的两类产物按摩尔比(0.5～1):1混合，乙酸酐作溶剂，无水乙酸钠作催化剂，反应温度100～150℃，反应时间1～5h。
22、结合上述反应式，制备方式及优选的反应条件如下：
23、a：将化合物1与化合物2按摩尔比(0.5～4):1混合，反应温度120～190℃，反应时间4～10h，优选170℃、8h；将化合物1与化合物2按摩尔比(0.5～4):1混合，超干乙腈作溶剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h，优选85℃、8h；
24、b：将化合物4和化合物5按摩尔比(0.5～1):1混合，超干乙腈作溶剂，碘化钾和碳酸铯作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h，优选85℃、8h；
25、c：①将化合物3和化合物6按摩尔比(0.5～1):1混合，超干乙腈作溶剂，三乙胺作催化剂，反应温度60～100℃，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一类硝基还原酶开启式半菁染料荧光探针，其特征在于，结构式为：
2.如权利要求1所述的半菁染料荧光探针，其特征在于，取代基的优选方案为：R1＝H；R2＝H；R3＝H；R4＝H；R5＝CH3或CH2CH3；R6＝H；R7＝H；R8＝H或OCH3；R9＝H或OCH3；R10＝苯或甲基苯；X＝S或C(CH3)2；Y＝Br或I；Z＝O或S；n＝0或1。
3.如权利要求2所述的半菁染料荧光探针，其特征在于，取代基进一步优选为：R1＝H；R2＝H；R3＝H；R4＝H；R5＝CH2CH3；R6＝H；R7＝H；R8＝OCH3；R9＝OCH3；R10＝甲基苯；X＝S；Y＝I；Z＝O；n＝0。
4.一种如权利要求1所述的半菁染料荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的半菁染料荧光探针的制备方法，其特征在于，所述含氮杂环优选为苯并噻唑、萘并噻唑、吲哚、苯并吲哚，亲电试剂优选为碘甲烷、碘乙烷、丙磺酸内酯、丁磺酸内酯，芳醛类衍生物优选为丁香醛、对羟基苯甲醛、4-羟基-1-萘甲醛、6-羟基-2-萘甲醛，硝基化合物优选为对硝基苄溴
6.如权利要求5所述的半菁染料荧光探针的制备方法，其特征在于，含氮杂环最优选为苯并噻唑，亲电试剂最优选为碘乙烷，芳醛类衍生物最优选为丁香醛。
7.一类如权利要求1所述的半菁染料荧光探针在溶液、细菌体系中识别或检测硝基还原酶的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述溶液可以为水溶性或有机溶剂体系，所述细菌可以为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
9.一种如权利要求1所述的半菁染料荧光探针在溶液中的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.一种如权利要求1所述的半菁染料荧光探针可视化鉴定临床致病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一类硝基还原酶开启式半菁染料荧光探针，其特征在于，结构式为：
2.如权利要求1所述的半菁染料荧光探针，其特征在于，取代基的优选方案为：r1＝h；r2＝h；r3＝h；r4＝h；r5＝ch3或ch2ch3；r6＝h；r7＝h；r8＝h或och3；r9＝h或och3；r10＝苯或甲基苯；x＝s或c(ch3)2；y＝br或i；z＝o或s；n＝0或1。
3.如权利要求2所述的半菁染料荧光探针，其特征在于，取代基进一步优选为：r1＝h；r2＝h；r3＝h；r4＝h；r5＝ch2ch3；r6＝h；r7＝h；r8＝och3；r9＝och3；r10＝甲基苯；x＝s；y＝i；z＝o；n＝0。
4.一种如权利要求1所述的半菁染料荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的半菁染料荧光探针的制备方法，其特征在于，所述含氮杂环优选为苯并噻...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。