【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，具体地说，是一种生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母及其构建方法与应用。
技术介绍
1、麦角硫因(egt)是一种天然的含硫组氨酸衍生物，主要存在于部分真菌和细菌中。麦角硫因最早是在研究破坏黑麦谷物的麦角真菌时发现的一种含硫化合物。因其具有出色的抗氧化活性，是一种天然抗氧化剂，具有抗光老化和抗氧化作用，清除自由基，保护dna免受氧化作用的损伤。egt的抗氧化能力远高于维生素c(beelman等，journal ofnutritional science，2020，9，e52)。麦角硫因价格较为昂贵，因此，能高效生产egt的技术具有巨大的市场价值。
2、真菌中的egt由egt1、egt2两个酶催化合成，目前已报道可以天然合成egt的微生物有粟酒裂殖酵母、胶红酵母、麦角菌和粗糙脉孢菌等，其中胶红酵母报道最高产量是通过过氧化氢胁迫刺激促进麦角硫因生产，产量为38mg/l(xiong等，food bioscience，2023，53，102745)。从天然麦角硫因生产菌株中去分析天然合成酶，是了解麦角硫因合成途径的必经之路。随着粗糙脉孢菌和麦角菌的egt1和egt2基因的功能验证，研究者发现不同来源的酶基因活性以及不同酶基因组合效应有所差异(van等，metabolic engineering，2022，70：129-142)。但是，目前公布的真菌来源的酶基因较为局限，更多的酶基因需要发现和改造，进而推动麦角硫因高效生产以达到工业化的需求。
3、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces m
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)菌株kme1-wz01，其含有麦角硫因合成基因egt1和egt2，所述的egt2基因为马克斯克鲁维酵母内源基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，egt2基因表达的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述的egtl基因为外源基因。现有技术中未见有含内源egt2基因的马克斯克鲁维酵母的报道。egt1基因和egt2基因表达的酶在下文中简称egt1酶和egt2酶，egt2酶又称为硒代半胱氨酸裂解酶。
2、所述菌株kme1-wz01的保藏编号为cgmcc no.27310，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年5月10日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。经检测菌株是存活状态。
3、优选地，所述的麦角硫因合成基因egt1来源于粗糙脉孢菌(neurospora crassa)，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
4、所述菌株kme1-wz01的构建方法为：将粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因egt1质粒转化到大肠杆菌dh5α克隆菌株中，采用菌落pcr进行阳性克隆筛选，将目的dna片段转化至马克斯克鲁维酵母出发菌株中，pcr检测为阳性的转化子经过测序验证，得到马克斯克鲁维酵母重组菌株，实验室命名为kme1-wz01。
5、本专利技术还公开了一种麦角硫因合成基因egt2，所述的egt2基因来源于所述的马克斯克鲁维酵母kme1-wz01，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
6、本专利技术还公开了一种所述的麦角硫因合成基因egt2的扩增引物对，所述扩增引物对的正向引物的序列如seq id no.3所示，反向引物的序列如seq id no.4所示。该扩增引物对可以快速、准确得到egt2的编码基因。
7、本专利技术还公开了一种麦角硫因合成基因egt2表达的酶，所述egt2酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8、马克斯克鲁维酵母kme1-wz01在生产麦角硫因中的应用，包括但不限于发酵法生产麦角硫因，亦可以作为底盘细胞进行进一步改造。
9、本专利技术还提供了一种马克斯克鲁维酵母kme1-wz01生产麦角硫因的方法，发酵培养基为碳源20g/l、酵母粉10-20g/l、蛋白胨20g/l，所述碳源选自葡萄糖、木糖或甘油，但不限于所列碳源种类。
10、优选地，碳源为甘油。
11、在发酵生产中，发酵培养基中还可以加入前体组氨酸和甲硫氨酸，用以增加麦角硫因的产量。所述组氨酸和甲硫氨酸的添加量均优选为1g/l。
12、本专利技术优点在于：
13、提供了一种新的能生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母重组菌株kme1-wz01。本专利技术还提供了来源于马克斯克鲁维酵母的内源麦角硫因合成基因egt2及其表达的酶，无需像目前报道的要同时导入外源egt1基因和egt2基因才能生产麦角硫因。本专利技术基因改造菌只需转入一种外源egt1基因即可，操作简单，为利用酵母底盘从头合成麦角硫因提供更简便的遗传操作模块。在kme1-wz01发酵生产麦角硫因过程中，通过添加前体组氨酸和甲硫氨酸用以增加麦角硫因的产量。在3l发酵罐中，不添加前体的情况下，7天即可合成浓度630mg/l的麦角硫因，展现了其良好的开发应用潜力，为生物法合成麦角硫因提供了一种新路径。
14、seq id no.1(马克斯克鲁维酵母kme1-wz01的egt2基因核苷酸序列)：
15、
16、
17、seq id no.2(马克斯克鲁维酵母kme1-wz01的egt2酶氨基酸序列)：
18、
19、seq id no.3(正向引物)：
20、5’-atgagctcgattccatttggacatc-3’。
21、seq id no.4(反向引物)：
22、5’-tcatgagcttgaagcttctttcctc-3’。
23、seq id no.5(粗糙脉孢菌egt1基因核苷酸序列)：
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1.一种生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株，其特征在于，含有麦角硫因合成基因Egt1和Egt2，所述的Egt2基因为马克斯克鲁维酵母内源基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Egt2基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的Egt1基因为外源基因；
2.根据权利要求1所述的生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母菌株，其特征在于，所述的麦角硫因合成基因Egt1来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
3.根据权利要求2所述的生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母菌株，其特征在于，所述菌株的构建方法为：将粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因Egt1质粒转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中，采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，将目的DNA片段转化至马克斯克鲁维酵母出发菌株中，PCR检测为阳性的转化子经过测序验证，得到马克斯克鲁维酵母重组菌株。
4.一种麦角硫因合成基因Egt2，其特征在于，所述的Egt2基因来源于权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母，其核苷酸序
5.一种权利要求4所述的麦角硫因合成基因Egt2的扩增引物对，其特征在于，所述扩增引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
6.一种权利要求4所述的麦角硫因合成基因Egt2表达的酶，其特征在于，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母在生产麦角硫因中的应用。
8.一种权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母生产麦角硫因的方法，其特征在于，发酵培养基为碳源20g/L、酵母粉10-20g/L、蛋白胨20g/L，所述碳源选自葡萄糖、木糖或甘油。
9.根据权利要求8所述的马克斯克鲁维酵母生产麦角硫因的方法，其特征在于，所述碳源为甘油。
10.根据权利要求8所述的马克斯克鲁维酵母生产麦角硫因的方法，其特征在于，所述发酵培养基中还加入前体组氨酸和甲硫氨酸，所述组氨酸和甲硫氨酸的添加量均为1g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)菌株，其特征在于，含有麦角硫因合成基因egt1和egt2，所述的egt2基因为马克斯克鲁维酵母内源基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，egt2基因表达的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述的egt1基因为外源基因；
2.根据权利要求1所述的生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母菌株，其特征在于，所述的麦角硫因合成基因egt1来源于粗糙脉孢菌(neurospora crassa)，其核苷酸序列如seq idno.5所示。
3.根据权利要求2所述的生产麦角硫因的马克斯克鲁维酵母菌株，其特征在于，所述菌株的构建方法为：将粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因egt1质粒转化到大肠杆菌dh5α克隆菌株中，采用菌落pcr进行阳性克隆筛选，将目的dna片段转化至马克斯克鲁维酵母出发菌株中，pcr检测为阳性的转化子经过测序验证，得到马克斯克鲁维酵母重组菌株。
4.一种麦角硫因合成基因egt2，其特征在于，所述的egt2基因...
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