一种骨靶向益生菌外囊泡及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医药材料领域，提供了一种骨靶向益生菌外囊泡及其制备方法，可以用于治疗骨质疏松制剂的制备

【技术实现步骤摘要】
Nissle 1917(ECN)。
[0010]本专利技术第二方面，提供一种所述的骨靶向益生菌外囊泡的制备方法，通过生物合成技术将
hCXCR4
和
ClyA
基因融合在益生菌膜表面完成菌株构建，然后利用细菌发酵法培养益生菌并收集益生菌外囊泡
。
[0011]进一步地，所述益生菌培养过程为：益生菌首先在
37℃、5
％
CO2和
220rpm
条件下分别在一级培养下生长
12
～
72
小时和二级培养下生长6～
24
小时，用
37℃
生长，
16℃
蛋白表达；然后生成的益生菌外囊泡使用
100
～
200g
低速离心收集培养液，即可获得有高效表达外源
BMP
‑2和
CXCR4
的益生菌发酵液
。
[0012]更进一步地，所述骨靶向益生菌外囊泡培养时可加
50mg/L
卡那霉素
。
[0013]进一步地，所述的益生菌外囊泡的收集过程为：发酵液先低速离心
1000
～
10,000g
，离心时间可选择5～
40min
；离心后的上清液用
0.22
μ
m
无菌过滤器过滤得菌液，菌液通过超速离心收集，超滤膜为
50
～
100kDa
，高速离心的速度为
50000
～
200000g
，时间为
30
～
80min
，为得到高纯外囊泡悬浊液，可重复离心2～4次；收集沉淀低温保存
。
[0014]本专利技术第三方面，提供所述骨靶向益生菌外囊泡在制备用于预防和治疗骨科病症的制剂中的应用
。
[0015]进一步地，所述的骨科病症选自骨质疏松
、
骨折或骨质流失产生的任意骨科疾病
。
[0016]进一步地，所述的预防和治疗骨科病症的制剂可以是药物制剂
、
食品或保健品等类型
。
[0017]更进一步地，所述骨靶向益生菌外囊泡制备的药物制剂选自片剂
、
胶囊剂
、
溶液剂
、
喷雾剂
、
软膏剂或凝胶剂中的任意一种
。
[0018]本专利技术第四方面，所述的骨靶向益生菌外囊泡在制备促成骨制剂中的应用
。
[0019]本专利技术创造性地通过生物合成学赋予细胞外囊泡更好的骨靶向性，并且进一步负载生长因子人骨形态发生蛋白
BMP
‑2，使其外囊泡应用于骨治疗制剂的制备中，以进行骨科疾病发病机制的研究和相关病症的治疗
。
[0020]本专利技术第五方面，所述的骨靶向益生菌外囊泡在制备促进骨髓间充质干细胞等干细胞的成骨分化促进剂中的应用
。
[0021]所述骨靶向益生菌外囊泡具有良好的靶向性和促成骨功能，可以对骨髓间充质干细胞等干细胞的成骨分化机制进行探索，为益生菌外囊泡在骨代谢中的促成骨性提供相关理论研究材料
。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下效果：
[0023]首先，本专利技术提供的骨靶向益生菌外囊泡具有较好的生物相容性
、
骨靶靶向性，其在细胞内化
、
骨科疾病治疗等方面显示出优势，并且其制备方法经济环保
、
可工业化量产
、
方便易得，有利于其进一步的产业应用；
[0024]其次，本专利技术通过动物实验证明了所述骨靶向益生菌外囊泡具有良好的靶向性，并且绝经后的雌性小鼠骨质疏松模型中，动物骨质疏松症状明显减轻，说明骨靶向益生菌外囊泡可以有效预防和治疗骨质疏松；
[0025]最后，本专利技术所述骨靶向益生菌外囊泡利用生物合成赋予益生菌外囊泡骨靶向性，提高外囊泡在骨组织中的作用量，高效输送骨生长因子，骨靶向的益生菌外囊泡促进成骨分化
、
矿化结节产生，促进
ALP、OCN、RUNX2
和
COL1
等成骨分化基因表达，是一种骨科疾病
靶向治疗的策略
。
附图说明
[0026]图
1.
本专利技术实施例中
BMP
‑2修饰后的益生菌外囊泡透射电镜图
。
[0027]图
2.
本专利技术实施例中
BMP
‑2和
CXCR4
修饰后的益生菌外囊泡透射电镜图
。
[0028]图
3.
本专利技术实施例中
BMP
‑2修饰后的益生菌外囊泡的动态光散射图
。
[0029]图
4.
本专利技术实施例中
BMP
‑2和
CXCR4
修饰后的益生菌外囊泡的动态光散射图
。
[0030]图
5.
本专利技术实施例中
BMP
‑2和
CXCR4
修饰后的益生菌外囊泡与骨髓间质干细胞共培养后的细胞增殖统计图
。
[0031]图
6.
本专利技术实施例中益生菌外囊泡的
ALP
活性图
。
[0032]图
7.
本专利技术实施例中益生菌外囊泡的矿化结节形成图
。
[0033]图
8.
本专利技术实施例中益生菌外囊泡对动物股骨的骨形成重建
Micro
‑
CT
图
。
[0034]图
9.
本专利技术实施例中益生菌外囊泡染色后在动物体内的骨靶向作用后的激光共聚焦图
。
具体实施方式
[0035]下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明
。
以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术
。
应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进
。
这些都属于本专利技术的保护范围
。
[0036]实施例1骨靶向益生菌外囊泡制备
[0037]构建菌株：使用一步克隆试剂盒构建
pCla
‑
BMP
‑2和
pCla
‑
BMP
‑2‑
CXCR4
，将
pCla
‑
BMP
‑2和
pCla
‑
BMP
‑2‑
CXCR4
转移复制到
ECN
的膜表面以获得工程化的
ECN
‑
BMP
‑2和
ECN
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种骨靶向益生菌外囊泡，其特征在于，所述骨靶向益生菌外囊泡的结构为双层磷脂层囊泡
。2.
根据权利要求1所述的外囊泡，其特征在于，骨靶向益生菌外囊泡的粒径为
20
～
2000nm。3.
根据权利要求1所述的外囊泡，其特征在于，骨靶向益生菌选自大肠杆菌
Escherichia coli Nissle 1917(ECN)、
鼠李糖乳杆菌
、
植物乳杆菌等可食用益生菌
。4.
一种权利要求1所述的骨靶向益生菌外囊泡的制备方法，其特征在于，通过生物合成技术将
hCXCR4
和
ClyA
基因融合在益生菌膜表面完成菌株构建，然后利用细菌发酵法培养益生菌并收集益生菌外囊泡
。5.
根据权利要求4所述的外囊泡的制备方法，其特征在于，所述益生菌培养过程为：益生菌首先在
37℃、5
％
CO2和
220rpm
条件下分别在一级培养下生长
12
～
72
小时和二级培养下生长6～
24
小时，用
37℃
生长，
16℃
蛋白表达；然后生成的益生菌外囊泡使用
100
～
200g
低速离心收集培养液，即可...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏佳灿，刘晗，井莹莹，
申请(专利权)人：苏州上海大学创新中心上海大学绍兴研究院，
类型：发明
国别省市：