工程菌株制造技术

本发明专利技术属于基因工程和微生物技术领域

【技术实现步骤摘要】
工程菌株AcsorEDM及其在产聚酮类化合物中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程和微生物

。
技术背景
[0002]呼吸作用作为生物体的供能方式，对于维持生物体的生长发育极为重要，作为呼吸作用产生的有害代谢产物，自由基，过氧化物及超氧化物等对于细胞衰老
、
畸变及个体的疾病发生具有明确的作用，同时氧化作用作为日常生活中最常发生的化学反应，常会造成金属制品的锈蚀及食品特别是油脂类制品的氧化变质，影响工业生产和日常生活，因此，开发新型长效抗氧化制剂对于延缓衰老，预防和治疗慢性疾病以及降低生产生活资料的自然损耗具有积极的意义
。
[0003]Sorbicillinoids
是一类聚酮类化合物，因结构的多样性而表现出多样的生物活性，尤其是具有良好的自由基清除能力和抗氧化活性
。
如在实验条件下
sorbicillinol
对
DPPH
自由基切割的
ED
50
值为
31.4
μ
M
，相同条件下常用的抗氧化剂二丁基羟基甲苯
(BHT)
及
α
‑
生育酚的
ED
50
值分别为
27.0
μ
M
和
22.0
μ
M。
与目前在用的抗氧化剂不同，
sorbicillinoids
的抗氧化能力还表现出时间依赖的特性，即随着时间的延长，化合物持续发挥抗氧化效果
。
然而，目前这类化合物产量偏低，严重制约了对其进行开发和应用
。
如何提高以
acresorbicillinol C
为代表的
sorbicillinoids
化合物的产量也至今未有报道
。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的是提供一株工程菌株
AcsorEDM
，所述工程菌株
AcsorEDM
是通过敲除顶头孢霉
AcsorE
基因获得；所述
AcsorE
基因的氨基酸序列如序列表
SEQ ID NO.1
所示
。
[0005]在本专利技术的具体实施例中，所述顶头孢霉为顶头孢霉
C10。
[0006]本专利技术还提供了工程菌株
AcsorEDM
在产
sorbicillinoids
中的应用
。
[0007]本专利技术另外也提供了一种工程菌株
AcsorEDM
的构建方法，包括如下步骤：质粒
pAgHB
‑
AcsorEDM
转化进顶头孢霉
C10
，并通过影印实验筛选在
TSA
培养基上具有潮霉素
(HygR)
抗性，但同时对
G418
敏感的阳性转化子，得工程菌株
AcsorEDM。
[0008]在本专利技术的具体实施例中，所述质粒
pAgHB
‑
AcsorEDM
的构建方法，包括：将质粒
pAgHB
用限制性内切酶
PacI
和
KpnI
酶切后，与以顶头孢霉
C10
基因组为模板，利用引物
LsorAM2+/LsorAM2
‑
进行
PCR
扩增的
LAcsorE
片段，和以顶头孢霉
C10
基因组为模板，利用引物
RsorAM2+/RsorAM2
‑
进行
PCR
扩增的
RAcsorE
片段进行
Gibson
组装
。
[0009]本专利技术提供的工程菌株可提高
sorbicillinoids
的产量，比出发菌株高3倍以上
。
附图说明
[0010]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作详细的说明
。
[0011]图1为
pAgHB
‑
AcsorEDM
质粒的构建示意图和酶切验证
。
[0012]其中
A
为
pAgHB
‑
AcsorEDM
质粒的构建示意图
。B
为
pAgHB
‑
AcsorEDM
质粒的
SmaI
酶切验证结果
。
[0013]图2为
AcsorE
缺失突变株的构建及验证图
。
[0014]其中，
A
为工程菌株
AcsorEDM
构建示意图；
B
为工程菌株
AcsorEDM
的
PCR
验证
。M
：
1kb DNA ladder
；
AcsorEDM1
‑3为重组工程菌株
AcsorEDM
的三个克隆
。
[0015]图3为
AcsorE
缺失突变株和野生型菌株的大米发酵产物
HPLC
检测图
。
[0016]图4为
Sorbicillinoids
高产工程菌株中
sorbicillinoids
产量对比分析图
。
具体实施方式
[0017]本专利技术提供一种高产聚酮类化合物
sorbicillinoids
工程菌及其构建方法，所述方法包括将顶头孢霉
C10
中的
AcsorE
基因敲除，得到的重组菌株即为高产聚酮类化合物
sorbicillinoids
工程菌
。
[0018]本专利技术还提供所述高产聚酮类化合物
sorbicillinoids
工程菌在生产聚酮类化合物
sorbicillinoids
中的应用
。
[0019]本专利技术中，聚酮类化合物
sorbicillinoids
产生菌为顶头孢霉
。
[0020]以下实施案例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围
。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件
。
[0021]以下实施例中涉及的主要实验材料：
[0022]表1本专利技术所使用的质粒
[0023][0024]表2本专利技术所使用的菌株
[0025][0026]表3本专利技术所用引物序列
[0027][0028]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
工程菌株
AcsorEDM
，其特征在于，所述工程菌株
AcsorEDM
是通过敲除顶头孢霉的
AcsorE
基因获得；所述
AcsorE
基因的氨基酸序列如序列表
SEQ ID NO.1
所示
。2.
依据权利要求1所述的工程菌株
AcsorEDM
，其特征在于，所述顶头孢霉为顶头孢霉
C10。3.
权利要求1或2中任一所述的工程菌株
AcsorEDM
在产聚酮类化合物中的应用
。4.
依据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述聚酮类化合物为
Trichopyrone、Oxosorbicillinol、Acresorbicillinol B、Trichotetronine、Demethyltrichodimerol、Trichodimerol、Acresorbicillinol A
和
Acresorbicillinol C
中的一种或多种
。5.
权利要求1所述的工程菌株
AcsorEDM
的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：质粒
pAgHB
‑
AcsorEDM
转化进顶头孢霉
C10
，并通过影印实验筛选在
TSA
培养基上具有潮霉素
(HygR)
抗性，但同时对
G418
敏感的阳性转化子，得工程菌株
AcsorEDM。6.
依据权利要求5所述的工程菌株
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘钢，潘园园，段成宝，王世元，姚永鹏，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：