一种与柑橘制造技术

本发明专利技术公开了一种与柑橘

【技术实现步骤摘要】
Mix
，
0.2
μ
L Phanta Max Super
‑
Fidelity DNA Polymerase
，
0.4
μ
L
正向引物，
0.4
μ
L
反向引物，
0.4
μ
LDNA
模板，
3.4
μ
L ddH2O。
[0015]优选地，所述
PCR
扩增的反应程序为：
95℃
预变性
5min
；
95℃
变性
30s
，
56℃
退火
15s
，
72℃
延伸
3min
，
35
个循环；最后
72℃
延伸
10min
，共进行两轮
PCR
反应
。
[0016]在进行结果判定时，若
PCR
扩增产物经凝胶电泳能检测到一条约
2000bp
的条带，则鉴定为高积累
γ
‑
松油烯的柑橘品种；若
PCR
扩增产物经凝胶电泳能检测到一条
400bp
的条带，且无
2000bp
的条带，则鉴定为低积累或不积累
γ
‑
松油烯的柑橘品种
。
[0017]本专利技术的有益效果是：
[0018]本专利技术首次提出了一种利用分子标记对柑橘
γ
‑
松油烯含量等级进行鉴定的新方法，并为此开发了一个新的
InDel
分子标记
。
该方法简单
、
快速且准确率高，为功能性柑橘新品种的选育提供了有力的技术支撑
。
附图说明
[0019]图1：不同柑橘种质成熟期果皮中
γ
‑
松油烯含量图
。
[0020]图2：不同柑橘品种分子标记凝胶电泳图
。A
为
24
个高积累
γ
‑
松油烯柑橘种质
(
编号
H1
‑
H24)
；
B
为
16
个高积累
γ
‑
松油烯柑橘种质
(
编号
H25
‑
H40)
；
C
为
23
个不积累或者低积累
γ
‑
松油烯柑橘种质
(
编号
L1
‑
L23)
；
D
为
23
个不积累或者低积累
γ
‑
松油烯柑橘种质
(
编号
L24
‑
L46)。
具体实施方式
[0021]下面结合具体实施例对本专利技术仅需详细说明
。
[0022]实施例1[0023]1.
材料与方法
[0024]1.1
材料与试剂
[0025]高保真酶
(Phanta Max Super
‑
Fidelity DNA Polymerase)
及
PCR
试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司
(Vazyme Biotech Co.,Ltd.)。PCR
引物由天津擎科生物技术有限公司
(Tsingke Biotechnology Co.,Ltd.)
合成
。
[0026]86
个不同柑橘种质的信息如表1所示
。
用改良
CTAB
法
[5]分别提取叶片基因组
DNA
，其中红橘
、
枳的
DNA
被用于重测序及筛选
InDel。
[0027]表
1.86
个柑橘种质的信息
[0028][0029][0030]1.2
实验方法
[0031]1.2.1InDel
引物设计及筛选
[0032]根据红橘和枳的基因组重测序数据，设计特异的高质量引物对，选取的位点均为
50bp
左右的大片段插入
/
缺失的位点，采用
SnpGene 4.3.6
软件在插入
/
缺失位点的上下游
200bp
设计引物
。
然后对
InDel
标记引物对进行有效性筛选
。
最终筛选出一对能区分高积累
γ
‑
松油烯和低积累或不积累
γ
‑
松油烯柑橘品种的分子
InDel
引物
23C
‑
Insert2
‑
Ind
，其核苷酸序列5’‑3’
分别为：
[0033]23C
‑
Insert2
‑
IndF
：
GCGCGGAATCAAATTTGTAAC
[0034]23C
‑
Insert2
‑
IndR
：
TTAATAGTAGTAGTGGATGCAGCC
[0035]该引物以高积累
γ
‑
松油烯的柑橘品种
DNA
为模板进行
PCR
扩增时，
PCR
产物经凝胶电泳检测会得到一条约
2000bp
的条带，少部分品种还会得到一条
400bp
的条带；而以低积累或不积累
γ
‑
松油烯柑橘品种材料为
DNA
模板进行
PCR
扩增时，绝大部分品种会得到一条
400bp
的条带
。
[0036]除去上下游各
200bp
序列，其中高积累
γ
‑
松油烯的柑橘品种特异的约
1500bp
核苷酸序列为：
[0037]TGTTGGGAAAATATGCTCTTTAAAAGCATATATGTTTATTTAATTGTAATAAACAGTTTTTCTGATTAATAAAATAAATGAGGTATTTTATTCAAATATCTTAATTGCATTAATATTTGTATTAAAGTCCATTTAATCATATTATATGTATTTATGTGATCACCATGTGGATTCACAGAAGACATAAATACAAGTTATCTTATGATTAAATAAATTTAGTTCGCAGTTGATAAATAAAGTGGGGCACTTTATTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种与柑橘
γ
‑
松油烯含量相关的
InDel
分子标记，其特征在于，所述
InDel
分子标记的引物序列如下：正向引物：
GCGCGGAATCAAATTTGTAAC
反向引物：
TTAATAGTAGTAGTGGATGCAGCC。2.
权利要求1所述的
InDel
分子标记在柑橘
γ
‑
松油烯含量等级鉴定中的应用
。3.
一种用于柑橘
γ
‑
松油烯含量等级鉴定的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1中所述的引物
。4.
一种柑橘
γ
‑
松油烯含量等级鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
1)
提取柑橘样品的基因组
DNA
；
2)
以步骤
1)
提取的基因组
DNA
为模板，用权利要求1中所述的引物进行
PCR
扩增；
3)
对步骤
2)
的
PCR
扩增产物进行凝胶电泳检测
。5.
如权利要求4所述的柑橘
γ
‑
松油烯含量等级鉴定方法，其特征在于：所述
PCR
扩增的反应体系为5μ
L 2
×
Phanta Max Buffer
，
0.2
μ
L dNTP Mix
，
0.2
μ
L Phan...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐娟，温欢，刘园，胡哲辉，陈嘉景，蒋友武，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：