一种定量检测人血浆中诺西那生的液相质谱联用方法技术

本发明专利技术公开了一种定量检测人血浆中诺西那生的液相质谱联用方法

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测人血浆中诺西那生的液相质谱联用方法


[0001]本专利技术涉及一种液相色谱串联质谱定量检测人血浆中诺西那生浓度的方法，属于药物分析

。

技术介绍

[0002]诺西那生（
Nusinersen
）为首个用于治疗罕见的脊髓性肌萎缩症（
spinal muscular atrophy
，
SMA
）的反义寡核苷酸类药物，于
2016
年获美国食品和药品管理局（
Food and Drug Administration
，
FDA
）批准，
2019
年在我国获批上市
。
诺西那生是通过鞘内注射的，可以绕过血脑屏障到达中枢神经系统
。
目前，该药在我国人群中的药代动力学（
PK
）和药效学（
PD
）特点尚不明确，因此，在中枢神经系统和循环系统以及关键器官组织中对其定量生物分析是至关重要的
。
[0003]反义寡核苷酸（
antisense oligonucleotide
，
ASO
）通常指由
15~25
个核苷酸组成，并且进行了某些化学修饰的短链核酸
。
目前，
ASO
类药物的分析方法类型大致分为二类：第一类色谱分析方法，包括
1、
高效液相色谱紫外
/
荧光法（
high
‑
performance liquid chromatography
‑
UV/Fluorescence
，
HPLC
‑
UV/FD
）；
2、
毛细管凝胶电泳
‑
紫外法（
capillary gel electrophoresis
‑
UV
，
CGE
‑
UV
）；
3、
液相色谱
‑
质谱联用（
liquid chromatography tandem mass spectrometry
，
LC
‑
MS/MS
）和液相色谱
‑
高分辨率高质量精度质谱（
liquid chromatography
‑
high resolution accurate mass
，
LC
‑
HRAM
）；第二类基于杂交的分析方法，包括
1、
基于杂交的酶联免疫吸附测定（
hybridized enzyme linked immunosorbent assay
，
HELISA
）和杂交
‑
流式细胞术（
hybridized flow cytometry
，
HFCM
）；
2、
基于杂交的
HPLC
‑
FD
方法；基于杂交的分析方法尤其是
HELISA
，因具有灵敏度高
、
样品前处理简单和通量高等特点，是临床前和临床研究中常用的分析方法
。
然而，在
HELISA
方法中也存在几个不可避免的局限性，包括与其代谢产物（如
N
‑
1、N
‑2等）的交叉反应性
、
狭窄的动态范围
、
较差的组织样品相容性及样品中抗药物抗体存在的可能影响，更重要的是该方法开发的周期较长且成本高
。
在诺西那生的临床前和临床研究中，采用的正是
HELISA
的方法
[1]。
相比之下，色谱分析方法，特别是
LC
‑
MS/MS
技术将高分离能力的液相色谱法与高灵敏度和选择性的质谱法结合起来，除了可以对在生物样品中的寡核苷酸进行准确的定量分析，其还具有特异性强
、
定量范围宽及可同时测定多种分析物
(
如寡核苷酸药物及其代谢物
)
的优势
[2]，此外，该方法不需要特殊试剂的设计和合成，方法更容易开发
、
开发周期短
、
实用性更强
。
[0004]《Results from a phase 1 study of nusinersen (ISIS
‑
SMN(Rx)) in children with spinal muscular atrophy.》
[3]报道了：诺西那生原研厂家进行药代动力学研究测定诺西那生浓度采用的是
HELISA
方法或电化学发光法
（
electrochemiluminescence
，
ECL
），
HELISA
方法存在的问题如上；
ECL
虽然更加灵敏，检测范围更宽，存在的问题是该方法可能也受诺西那生的代谢产物发生的交叉反应及抗药物抗体存在等影响，影响诺西那生含量测定
[4]，此外该方法需要合成特殊的碱基序列及试剂，开发周期长
。
[0005]申请号
201910432682.6
的中国专利
《
检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法
》
[5]公开了：取含有中期因子反义寡核苷酸的待测猕猴血浆，向所述猕猴血浆中加入流感泰德作为内标液，再加入适量氨水溶液
、
苯酚
/
二氯甲烷混合液，然后依次进行涡流后离心，以便得到处理后血样；取所述血样的上清液并进行
LC/MS/MS
分析；绘制标准曲线，并根据标准曲线法对所述待测猕猴血浆中所述中期因子反义寡核苷酸的含量进行定量分析，猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸的最低定量
0.18
μ
g/mL
，该专利虽然公开了采用
HPLC
‑
MS/MS
检测猕猴血浆中中期因子反义寡核苷酸含量的方法，但诺西那生与中期因子反义寡核苷酸肽段结构不同，分子量不同，所以该方法未毕适用于人血浆中诺西那生的检测，更关键的是该方法的最低定量限相对较高，
《Results from a phase 1 study of nusinersen (ISIS
‑
SMN(Rx)) in children with spinal muscular atrophy.》
[3]和
《Treatment of infantile
‑
onset spinal muscular atrophy with nusiners本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种定量检测人血浆中诺西那生含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）配制标准曲线工作溶液：所述标准曲线工作溶液中诺西那生浓度分别为
100
，
200
，
400
，
1000
，
4000
，
8000
，
16000
，
20000ng/mL
；（2）配制内标工作溶液：所述内标工作溶液中格列吡嗪浓度为
500ng/mL
；（3）配制人血浆标准曲线样品：在湿冰条件下使用人血浆与步骤（1）中所述标准曲线工作溶液以适当比例混合配制人血浆标准曲线样品，人血浆标准曲线样品中诺西那生的浓度分别是
5.00、10.0、20.0、50.0、200、400、800、1000ng/mL
；（4）待测人血浆样品及人血浆标准曲线样品的处理：分别取待测人血浆样品及步骤（3）中配制的人血浆标准曲线样品各
100
µ
L
，在湿冰条件下，分别加入
100
µ
L 0.3%
三乙胺乙腈溶液，然后分别在
2500rpm
条件下振荡
5min
后，在
4℃ 3500g
条件下离心
5min
，分别取上清液
100
µ
L
，
40℃
氮气吹干，然后分别加入
100
μ
L
所述内标工作溶液进行复溶，分别在
800rpm
条件下振荡
5min
后，
4℃
下
3500g
离心
1min
，分别取上清液，即为处理后样品；（5）处理后样品分别进行
LC
‑
MS/MS
分析：所述
LC
‑
MS/MS
分析的色谱条件如下：色谱柱：
Waters Xbridge C18
，
130
Å
，
3.5
μ
m
，
4.6*50mm
；流动相
A
：含
0.5%
三乙胺和
0.5%
六氟异丙醇的水溶液；流动相
B
：含
0.5%
三乙胺和
0.5%
六氟异丙醇的乙腈溶液；强洗针液：
0.1%
三乙胺溶在甲醇
‑
乙腈
‑
异丙醇
‑
水混合溶液中，所述甲醇
‑
乙腈
‑
异丙醇
‑
水混合溶液为体积比为1：1：1：1的甲醇
、
乙腈
、
异丙醇和水配制；弱洗针液：
10%
甲醇水溶液，所述
10%
甲醇水溶液为体积比
10
：
90
的甲醇和水配制；流速：
0.800mL/min
；进样量：
10
μ
L
；洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～
0.01min
，
A
相为
95%
，
B
相为5％；
0.01
～
2.00min
，
A
相从
95%
降为
65%
，
B
相从5％升到
35%
；
2.00
～
3.00min
，
A
相从
65%
降为
5%
，
B
相从
35
％升到
95%
；
3.00
～
3.80min
，
A
相为
5%
，
B
相为
95%
；
3.80
～
3.85min
，
A
相从
5%
升到
95%
，
B
相从
95
％降为
5%
；
3.85
～
4.20min
，
A
相为
95%
，
B
相为5％；
4.20
～
4.25min
，
A
相从
95%
降为
5%
，
B
相从5％升到
95%
；
4.25
～
4.60min
，
A
相为
5%
，
B
相为
95%
；
4.60
～
4.65min
，
A
相从
5%
升到
95%
，
B
相从
95
％降为
5%
；
4.65
～
5.00min
，
A
相为
95%
，
B
相为5％；
5.00
～
5.05min
，
A
相从
95%
降为
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，许婷婷，左玮，刘鑫，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：