向导制造技术

本发明专利技术提供了一种新型

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】向导RNA设计及用于V型Cas系统的复合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于
2021
年1月5日提交的美国临时专利申请序列号
63/133,945
的提交日的权益，如同在此充分陈述一样，该临时专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文中
。


[0003]本专利技术涉及基因编辑领域
。

技术介绍

[0004]研究人员正在积极地探索成簇规律间隔短回文重复
(CRISPR)
系统的使用，以便修饰
DNA。
到目前为止，在此领域中的绝大部分工作已放在
Cas9
系统中
。
在这些系统中，核苷酸的两个单独链或单链核苷酸的区域形式的
tracrRNA(
反式激活
CRISPR RNA)
和
crRNA(CRISPR RNA)
杂交以招募
Cas9
蛋白，然后将
Cas9
蛋白引导至与
crRNA
内部的序列互补的
DNA
位置
。
因此，
DNA
内部的互补序列变成靶位点，并且
Cas9
蛋白基于其功能结构域可在此靶位点处引发编辑
。
[0005]尽管现在充分认可了
Cas9
系统的能力，但这些系统并非在所有用途中都是有效的
。Cas9
系统的局限之一是
Cas9<br/>系统可对其起作用的功能结构域由所使用的
Cas9
蛋白的功能结构域所限定
。
[0006]其他的
Cas
蛋白是已知的
。
在这些其他的
Cas
蛋白中，尚未对它们的潜力进行充分发掘，它们是在
V
型家族中
。
当人们试图在靶位点或其附近引入多个编辑时，来自
V
型家族的酶的使用尤其未得到充分发掘
。
因此，有需求开发改进的
gRNA(
向导
RNA)
和复合物以及包含并使用它们的系统
。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供新型且非显而易见的
gRNA
‑
配体结合复合物
、
碱基编辑复合物，以及用于碱基编辑和基因组修饰的方法
。
通过使用本专利技术各种实施方式，技术人员能够高效地且有效地离体
、
在体外
、
和在体内引发碱基编辑
。
此外，本专利技术的一些实施方式提供了模块化设计，这些设计允许将相同的
V
型
Cas
蛋白引导至不同的靶向位点，并且可选地在相同或不同位点与不同的效应蛋白结合
。
[0008]根据第一实施方式，本专利技术提供一种
gRNA
‑
配体结合复合物，其中，该
gRNA
‑
配体结合复合物包含：
(a)gRNA
，其中，该
gRNA
含有
60
至
210
个核苷酸或
80
至
180
个核苷酸，并且该
gRNA
包含
(i)crRNA
序列，其中，该
crRNA
序列的长度为
36
至
60
个核苷酸或
35
至
60
个核苷酸，并且该
crRNA
序列包含
Cas
结合区
(
其中，该
Cas
结合区的长度为
18
至
30
个核苷酸
)
和靶向区
(
其中，该靶向区的长度为
18
至
30
个核苷酸
)
，以及
(ii)tracrRNA
序列，其中，该
tracrRNA
序列的长度为
45
至
120
核苷酸，并且其中，该
tracrRNA
序列包含反重复区和远端区，其中，在
Cas
结合区的超过至少
18
个连续核苷酸上，反重复区与
Cas
结合区至少
80
％互补，并且
Cas
结
合区和反重复区能够杂交形成杂交区，其中，该杂交区能够保持与
V
型
Cas
蛋白的
RNA
结合结构域的结合；以及
(b)
配体结合基团，其中，配体结合基团
(i)
直接结合
gRNA
，或者
(ii)
通过接头结合
gRNA。
[0009]根据第二实施方式，本专利技术提供一种碱基编辑复合物，包含：本专利技术的
gRNA
‑
配体结合复合物和
V
型
Cas
蛋白，其中，
gRNA
‑
配体结合复合物的
Cas
结合区和反重复区与
V
型
Cas
蛋白结合
。
可选地，配体结合基团与配体可逆地结合
,
该配体附接效应分子到或者是效应分子的一部分
。
[0010]根据第三实施方式，本专利技术提供一种用于碱基编辑的方法
。
该方法包括将本专利技术的碱基编辑复合物暴露于双链
DNA(“dsDNA”)
或单链
DNA(“ssDNA”)。
该碱基编辑复合物可在允许碱基编辑的条件下暴露于
dsDNA
或
ssDNA。
[0011]根据第四实施方式，该
gRNA
‑
配体结合复合物包含或编码
SEQ ID NO:28。
[0012]根据第五实施方式，该
gRNA
‑
配体结合复合物包含或编码
SEQ ID NO:59
至
SEQ ID NO:65
中的任一个
。
[0013]根据第六实施方式，该
gRNA
‑
配体结合复合物包含或编码
SEQ ID NO:67
至
SEQ ID NO:71
中的任一个
。
[0014]当效应物附接到
(
或含有
)
配体时，该系统具有模块化设计
。
该配体结合基团存在于
gRNA
‑
配体结合复合物内部，从而允许该复合物合与相应的结合有
(
或包含于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
‑
配体结合复合物包含：
a.gRNA
，其中所述
gRNA
含有
60
至
210
个核苷酸，且所述
gRNA
包含：
i.crRNA
序列，其中所述
RNA
序列的长度为
35
至
60
个核苷酸，且所述
crRNA
序列包含
Cas
结合区和靶向区，其中所述
Cas
结合区的长度为
18
至
30
个核苷酸，其中所述靶向区的长度为
18
至
30
个核苷酸，以及
ii.tracrRNA
序列，其中所述
tracrRNA
序列的长度为
45
至
120
个核苷酸，且其中所述
tracrRNA
序列包含反重复区和远端区，其中在所述
Cas
结合区的超过至少
18
个连续核苷酸上，所述反重复区与所述
Cas
结合区至少
80
％互补，且所述
Cas
结合区与所述反重复区能够杂交形成杂交区，其中所述杂交区能够保持与
V
型
Cas
蛋白的
RNA
结合结构域结合；以及
b.
配体结合基团，其中所述配体结合基团
(i)
直接结合所述
gRNA
，或者
(ii)
通过接头结合所述
gRNA。2.
根据权利要求1所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
由核苷酸单链形成，且所述核苷酸单链包括所述
crRNA
序列和所述
tracrRNA
序列
。3.
根据权利要求2所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
Cas
结合区与所述反重复区之间存在环序列
。4.
根据权利要求3所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述环序列的长度为4至
40
个核苷酸
。5.
根据权利要求1所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
由第一核苷酸链和第二核苷酸链组成，其中所述第一核苷酸链包含所述
tracrRNA
序列，且所述第二核苷酸链包含所述
crRNA
序列
。6.
根据权利要求1至5中任一项所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
和所述配体结合基团中的至少一个包含至少一个修饰
。7.
根据权利要求3所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述环序列包含至少一个修饰
。8.
根据权利要求7所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述至少一个修饰是1至
30
个
2'
修饰
。9.
根据权利要求8所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述1至
30
个
2'
修饰是1至
10
个
2'
修饰
。10.
根据权利要求9所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述1至
10
个
2'
修饰位于所述靶向区中
。11.
根据权利要求9所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述1至
10
个
2'
修饰位于所述
Cas
结合区中
。12.
根据权利要求9所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述1至
10
个
2'
修饰位于所述反重复区中
。13.
根据权利要求9所述的
RNA
‑
配体结合复合物，其中所述1至
10
个
2'
修饰位于所述远端区中
。14.
根据权利要求7所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述至少一个修饰是至少一个硫代磷酸酯连接
。15.
根据权利要求6所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述至少一个修饰是至少一个硫代磷酸酯连接
。
16.
根据权利要求
15
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述硫代磷酸酯连接位于所述靶向区中
。17.
根据权利要求
15
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述硫代磷酸酯连接位于所述
Cas
结合区中
。18.
根据权利要求
15
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述硫代磷酸酯连接位于所述反重复区中
。19.
根据权利要求
15
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述硫代磷酸酯连接位于所述远端区中
。20.
根据权利要求1至
19
中任一项所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述配体结合基团包括核苷酸序列，且所述配体结合基团的核苷酸序列包含至少一个
2'
修饰核苷酸
。21.
根据权利要求
20
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中在所述配体结合基团中的所述
2'
修饰核苷酸是
2'
‑
O
‑
甲基修饰核苷酸
、2'
‑
氟修饰核苷酸或2‑
氨基嘌呤修饰核苷酸
。22.
根据权利要求1至
21
中任一项所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述配体结合基团包含硫代磷酸酯连接
。23.
根据权利要求2所述的
RNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
具有
5'
末端，且所述配体结合基团在
gRNA
的
5'
末端直接结合至所述
gRNA。24.
根据权利要求2所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
具有
3'
末端，且所述配体结合基团在
gRNA
的
3'
末端直接结合至所述
gRNA。25.
根据权利要求2所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
具有
3'
末端和
5'
末端，且所述配体结合基团直接结合所述
gRNA
的
3'
末端和
5'
末端之外的核苷酸
。26.
根据权利要求
25
所述的
RNA
‑
配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述靶向区中的
gRNA。27.
根据权利要求
25
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述
Cas
结合区中的
gRNA。28.
根据权利要求
25
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述反重复区中的
gRNA。29.
根据权利要求
25
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述远端区中的
gRNA。30.
根据权利要求3所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述环序列处的
gRNA。31.
根据权利要求1所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
包含环序列，且所述配体结合基团直接结合所述环序列处的
gRNA。32.
根据权利要求1至
22
中任一项所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
‑
配体结合复合物包含所述接头，且所述配体结合基团通过所述接头结合所述
gRNA。33.
根据权利要求2所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
具有
5'
末端，且所述接头在所述
gRNA
的
5'
末端结合所述
gRNA。34.
根据权利要求
32
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
具有
3'
末端，且所述接头在所述
gRNA
的
3'
末端结合所述
gRNA。35.
根据权利要求
32
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述
gRNA
具有
3'
末端和
5'
末
端，且所述接头在所述
3'
末端或所述
5'
末端外的核苷酸处结合所述
gRNA。36.
根据权利要求
35
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述接头在所述靶向区中结合所述
gRNA。37.
根据权利要求
35
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述接头在所述
Cas
结合区中直接结合所述
gRNA。38.
根据权利要求
35
所述的
RNA
‑
配体结合复合物，其中所述接头在所述反重复区中直接结合所述
gRNA。39.
根据权利要求
35
所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述接头在所述远端区中结合所述
gRNA。40.
根据权利要求2所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中在所述
Cas
结合区与所述反重复区之间存在环序列，且所述
gRNA
‑
配体结合复合物包含所述接头，其中所述接头结合所述环序列
。41.
根据权利要求
32
至
40
中任一项所述的
gRNA
‑
配体结合复合物，其中所述接头选自由经修饰和无修饰的寡核苷酸
、
经修饰和无修饰的寡肽
、
无机基团
、
经修饰和无修饰的多糖
、
经修饰和无修饰的脂
、
及其组合所组成的组
。42.
根据权利要求
41
...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：地平线探索有限公司，
类型：发明
国别省市：