一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法

【技术实现步骤摘要】
一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法
。

技术介绍

[0002]裂殖壶菌（
Schizochytrium limacinum
）是一种海洋真菌，属于破囊壶菌科（
Thraustochytriaceae
），是一类海洋异养微生物，显微镜观察呈单细胞
、
球形，常分布于海洋
、
盐水湖
、
河口以及红树林等地区
。
裂殖壶菌可通过异养繁殖生产，其生长繁殖快，生产不受季节影响，且适宜发酵罐大规模培养
。
裂殖壶菌能够大量积累对人类有益的物质，如：油脂
、
色素
、
非皂化物等，其中油脂占生物量比例达
50
‑
70
％，多不饱和脂肪酸占总油脂的
40
‑
70
％
。
裂殖壶菌合成的多不饱和脂肪酸主要包括二十碳五烯酸（
EPA
）
、
二十二碳六烯酸（
DHA
）等
。
[0003]EPA
是一种具有 20 个碳原子和 5 个顺式双键的多不饱和脂肪酸，对高等动物和人体的重要性，在临床和流行病理学等研究中已经得到验证，对于抗炎
、
抗癌
、
预防心血管疾病和糖尿病有重要作用
。EPA
因其重要的生理功能而广泛地应用于食品
、
医药
、
饲料行业等各个领域
。
[0004]人们对 n
‑
3 多不饱和脂肪酸的高度关注，特别是对其中的 DHA 和 EPA 做了大量研究，发现其功能有抗癌
、
抗炎作用，促进神经系统和视觉系统的发育，防止心血管疾病等重要作用
。
因此，从裂殖壶菌中提取 n
‑
3 多不饱和脂肪酸也逐渐成为备受关注的一个新研究热点
。
[0005]裂殖壶菌作为生产
DHA
和
EPA
的新生生物资源，如何提高其
DHA
和 EPA
产量成为人们研究的热点
。
关于裂殖壶菌生产多不饱和脂肪酸的研究主要集中在
DHA
的生物合成
、
培养基及培养条件的优化和工业化大规模生产工艺的探索上，对于
EPA
产量研究相对较少
。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，故本专利技术主要利用现代生物科学技术，通过生物工程方法对裂殖壶菌进行遗传改造，为从根本上提高其合成能力，进而提高
EPA
产量
。
[0007]本专利技术提供一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，利用同源重组的方法对裂殖壶菌中的
seipin
基因进行敲除，
seipin
基因序列如
SEQ ID NO .7
所示，包括以下步骤：1）将野生型裂殖壶菌菌株经过同源重组处理；2）将同源重组处理后的裂殖壶菌菌株进行筛选性平板培养基定向初筛，平板上能够生长出来形态大的菌落视为可能高产的菌株；3）将初筛的菌株进行指标测定，筛选后获得高产
EPA
菌株
。
[0008]其中步骤
1)
中所述的同源重组处理方法对裂殖壶菌中的
seipin
基因进行敲除，
seipin
基因序列如
SEQ ID NO .7
所示，
裂殖壶菌的培养裂殖壶菌裂殖壶菌
(Schizochytrium sp.ATCC 20888)
，购自美国典型培养物保藏中心
。
[0019]裂殖壶菌（
SchizochytriumSGY
）菌株由本实验室
‑
80℃
保存
。
活化的
SchizochytriumSGY
菌株在
GPY
培养基中作为种子培养
。
其
GPY
液体培养基配方是：
2%
葡萄糖
、1%
蛋白胨
、0.5%
酵母粉
、2%
海盐
。
固体培养基：
2%
葡萄糖
、1%
蛋白胨
、0.5%
酵母粉
、2%
海盐
、2%
琼脂粉
。1
×
105Pa、115℃
灭菌
30 min。
在无菌超净台中，利用接种环挑取生长状态良好的裂殖壶菌单菌落，接种于装有
50mLGPY
液体培养基的锥形瓶中，于
28℃、180 rpm
摇床中培养
24
‑
48h。
然后通过镜检将生长状态良好的菌株作为种子液传代培养，保证裂殖壶菌的新鲜生长状态
。
[0020]实施例2裂殖壶菌的对博莱霉素（
Zeocin
）敏感实验（1）菌悬液制备：取
2%
上述种子液接种于装有
50mL
灭菌的
GPY
液体培养基的锥形瓶中，于
28℃、180 rpm
摇床中培养
24
‑
48h。
取适量菌液稀释后，调整细胞
OD
660nm 值为
0.3
‑
0.4
之间
。
用无菌去离子水清洗三次，最后一次用
500
µ
l
重悬，待用
。
[0021]（2）浓度梯度抗生素培养基：用
GPY
固体培养基为基础性培养基，所用筛选试剂为
Zeocin
，浓度梯度（
µ
g/ml
）为0，
20
，
30
，
40
，
50
，
60
，
70
，
80
，
90
，
110。
[0022]（3）敏感实验：用上述制备的菌悬液和抗性平板，取
50
µ
l
菌悬液涂布于不同浓度的抗性平板中，放于
28℃
培养箱中避光培养
24
‑
48h。
[0023]经抗性平板培养基定向筛选后，得出该裂殖壶菌对
zeocin
存在一定抗性，并在0‑
70
µ
g/ml
之间还有会存在一部分的生长，在
80
µ
g/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，包括以下步骤：1）将野生型裂殖壶菌菌株经过同源重组处理；2）将同源重组处理后的裂殖壶菌菌株进行筛选性平板培养基定向初筛，平板上能够生长出来形态大的菌落视为可能高产的菌株；3）将初筛的菌株进行指标测定，筛选后获得高产
EPA
菌株，其特征在于：其中步骤
1)
中所述的同源重组处理方法为利用同源重组的方法对裂殖壶菌中的
seipin
基因进行敲除，
seipin
基因序列如
SEQ ID NO .7
所示，包括以下步骤：（1）以
Schizochytrium SGY
基因组
DNA
为模板，
SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6
所示的序列为引物，
PCR
扩增出
SPNSI
基因的上游
SEIUP
（
SEQ ID NO 1/ SEQ ID NO 2
）和下游
SEIDOWN
（
SEQ ID NO 5/ SEQ ID NO 6
）基因；（2）以
ZEOCIN
质粒为模板，
SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4
为引物，
PCR
扩增出
BloR
基因；（3）以上游
SEIUP、
下游
SEIDOWN
以及
BloR
基因为模板，
SEQ ID NO 1/ SEQ ID NO 6
为引物，
PCR
扩增三基因连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：王致鹏，马岩，宋磊，叶景润，杜昌云，张新月，
申请(专利权)人：山东天智绿业生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：