羊草内源再生因子组合在遗传转化中的应用及羊草的高效遗传转化方法技术

技术编号：39805771 阅读：7 留言：0更新日期：2023-12-22 02:39

本发明专利技术涉及羊草内源再生因子组合在遗传转化中的应用及羊草的高效遗传转化方法，属于植物组培技术和植物转基因技术领域

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【技术实现步骤摘要】
羊草内源再生因子组合在遗传转化中的应用及羊草的高效遗传转化方法

[0001]本专利技术属于植物组培技术和植物转基因
，涉及一种羊草内源再生因子组合在遗传转化中的应用及羊草的高效遗传转化方法，具体涉及一种诱导羊草幼穗产生愈伤组织，并以这些愈伤组织作为根癌农杆菌侵染对象，利用外源载体靶向激活羊草内源再生因子组合的表达，以建立高效
、
快速的羊草遗传转化和再生体系
。

技术介绍

[0002]羊草
(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)
又名碱草，为禾本科赖草属多年生牧草和生态草，广泛分布于欧亚大陆，是天然草场上的重要牧草之一
。
因其具有品质优良
、
适口性好
、
耐寒
、
耐旱
、
耐盐碱等优点，也被誉为“禾草之王”。
除作为优质牧草外，羊草根茎穿透和扩展能力极强，能形成发达的地下根茎网络，盘结固持土壤作用强大，是很好的草原修复和水土保持植物
。
在改善我国北方草原生态环境
、
修复退化草原及发展草原畜牧业等方面具有重要作用
。
[0003]羊草本身存在诸如“三低”(
即结实率低
、
出苗率低
、
产草量低
)
，自交不亲和等问题，极大限制了先进
、
高效育种技术的应用，导致目前羊草育种工作进展缓慢，优良品种极其短缺
。
解析羊草“...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种羊草内源再生因子组合在羊草遗传转化中的应用，其特征在于，所述羊草内源再生因子组合选自以下组合
(1)
‑
(3)
中任一种：
(1)LEC1
和
LEC2
；
(2)LEC2
和
AGL15
；和
(3)BBM
和
LEC2。2.
一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括
PDV
载体和靶向激活权利要求1所述及的羊草内源再生因子组合的
sgRNA
；其中所述
PDV
载体包括
SunTag
系统和
XVE
系统，所述
XVE
系统利用基于
CaMV 35S
改造的组成型启动子
G10
‑
90
驱动
XVE
融合蛋白表达，所述靶向激活权利要求1所述及的羊草内源再生因子组合的
sgRNA
位于所述
SunTag
系统中，且由水稻
OsU3
启动子驱动表达
。3.
根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，靶向激活羊草内源再生因子组合
(1)
中的
LEC1
和
LEC2
的
sgRNA
的核苷酸序列分别如
SEQ ID NO:1
和
SEQ ID NO:2
所示；和
/
或靶向激活羊草内源再生因子组合
(2)
中的
LEC2
和
AGL15
的
sgRNA
的核苷酸序列分别如
SEQ ID NO:3
和
SEQ ID NO:4
所示；和
/
或靶向激活羊草内源再生因子组合
(3)
中的
BBM
和
LEC2
的
sgRNA
的核苷酸序列分别如
SEQ ID NO:5
和
SEQ ID NO:2
所示
。4.
一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转化有权利要求2或3所述的重组载体
。5.
根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为根癌农杆菌
。6.
一种羊草的高效遗传转化方法，其特征在于，所述遗传转化方法包括：利用权利要求5所述的宿主细胞侵染羊草愈伤组织以靶向激活羊草内源再生因子组合的表达
。7.
根据权利要求6所述的遗传转化方法，其特征在于，所述遗传转化方法包括以下步骤：
1)
羊草幼穗愈伤组织诱导：以羊草幼穗为外植体在诱导培养基上诱导愈伤组织，待外植体长出愈伤组织后，在无菌的环境中将愈伤组织转移到继代培养基上进行继代培养，得到状态良好的胚性愈伤组织；
2)
侵染与共培养：向步骤
1)
所得胚性愈伤组织中加入乙酰丁香酮侵染液重悬的权利要求5所述及的宿主细胞进行侵染，侵染结束后对所述胚性愈伤组织进行暗培养，得到共培养愈伤组织；
3)
恢复培养：将步骤
2)
所得培养愈伤组织转移至恢复培养基上进行恢复培养；
4)
筛选培养：将步骤
3)
恢复培养后的愈伤组织转移到筛选培养基上进行筛选培养，得到抗性愈伤组织；
5)
分化培养：将步骤
4)
所得抗性愈伤组织转移到分化培养基上进行分化培养，并在继代分化培养基上继代培养，直至得到长至1‑
2cm
高的羊草分化幼苗；和
6)
生根培养：将步骤
5)
所得羊草分化幼苗转移至生根培养基上培养至羊草生根，得到羊草转基因植株
。8.
根据权利要求7所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤
1)
中所述诱导培养基的配方为：
4.0
‑
5.0g/L MS
基础培养基，
4.8
‑
5.2mg/L 2,4
‑
D
，
1.4
‑
1.6mg/L 6
‑
BA
，
25
‑
35g/L
蔗糖，
3.5
‑
4.5g/L
植物凝胶，
pH
＝
5.7
‑
5.9
；所述继代培养基的配方为：
4.0
‑
5.0g/L MS
基础培养基，
250
‑
350mg/L
水解酪蛋白，
450
‑
550mg/L
脯氨酸，
80
‑
120mg/L
肌醇，
0.8
‑
1.2mg/L 2,4
‑
D
，
35
‑
45g/L
蔗糖，
3.5
‑
4.5g/L
植物凝胶，
pH
＝
5.7
‑
5.9
；和
/
或步骤
2)
中所述乙酰丁香酮侵染液的配方为：
0.4
‑
0.5g/L LS
基础培养基，
0.4
‑
0.5g/L MS
基础培养基，
0.4
‑
0.6g/L MES
，8‑
12g/L
葡萄糖，
90
‑
110
μ
M/L
乙酰丁香酮，
pH
＝
5.7
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹晓风，宋显伟，陈磊，唐善杰，赵庆华，刘启昆，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：

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