一种制造技术

本申请涉及一种

【技术实现步骤摘要】
一种PCR预混反应液及其应用


[0001]本申请属于生化检测技术领，具体涉及一种
PCR
预混反应液及其应用
。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应
(Polymerase Chain Reaction,PCR)
是一种体外核酸扩增技术，是分子生物学研究中必不可少的一部分
。
其扩增过程包括3个步骤，分别是变性
、
退火和延伸；变性是指通过高温加热
(
如加热到
95℃)
使
DNA
双链模板解离为单链，退火是指引物与模板
DNA
分子通过碱基互补配对的原则结合的过程，延伸是指
DNA
聚合酶沿着模板从引物的3’
末端开始复制延伸，上述3个步骤经历
25
‑
40
个循环后，即可得到经历指数倍数扩增的目标
DNA
分子
。
[0003]实时荧光定量聚合酶链式反应
(qPCR)
是一种将
PCR
扩增与检测同时进行的技术，在进行
qPCR
反应时，通过检测对数扩增期荧光信号的积累，从而获得精确的
PCR
产物的量
。
该方法简便
、
快速，常被用于分子诊断
、
食品检测及法医检测等领域
。SYBR GreenⅠ是
qPCR
中一种常用的染料，其可以非特异性结合双链
DNA
分子，在
PCR
循环过程中随着
PCR
产物的增加呈现出增强的荧光信号，实现对目标分子的检测
。
[0004]然而，
SYBR GreenⅠ染料可以检测所有的双链
DNA
分子，包括非特异性的扩增产物
。
因此，优化
SYBR GreenⅠ染料的
PCR
反应体系，降低非特异性扩增，从而提高对目标
DNA
分子的检测准确性是十分有必要的
。
在对
DNA
分子进行甲基化检测时，
DNA
往往需要经亚硫酸氢盐
(BS)
处理，当
DNA
分子经历
BS
转化以后，未甲基化的胞嘧啶会转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变
。
经历亚硫酸氢盐转化的
DNA
分子，其核苷酸多态性降低，二级结构复杂，且部分序列可能富含
CG
二核苷酸
。
因此，在使用
qPCR
法检测经
BS
转化后的
DNA
模板时，一款经过优化的
SYBR Green PCR mix
是十分急需的
。

技术实现思路

[0005]基于此，本申请提供一种
PCR
预混反应液并将其用于亚硫酸氢盐转化后
DNA
的扩增，能够提高检测的敏感性及特异性
。
[0006]具体技术方案如下：
[0007]一种
PCR
预混反应液，所述
PCR
预混反应液包含如下组分：
[0008]5mM
‑
80mM Tris
‑
HCl、1mM
‑
4mM MgCl2、10mM
‑
250mM KCl、10mM
‑
80mM(NH4)2SO4和
PCR
反应增强剂；所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱
、
海藻糖
、BSA
和
Triton X
‑
100
中的一种或者多种；
[0009]其中，所述
TMSO
在所述
PCR
预混反应液中的用量为
0.5M
‑
1M
；所述
TMAC
在所述
PCR
预混反应液中的用量为
20mM
‑
40mM
；所述甜菜碱在所述
PCR
预混反应液中的用量为
1.5M
‑
3M
；所述海藻糖在所述
PCR
预混反应液中的用量为
0.1M
‑
0.2M
；所述
BSA
在所述
PCR
预混反应液中的用量为
0.13mg/mL
‑
0.25mg/mL
；所述
Triton X
‑
100
在所述
PCR
预混反应液中的用量为
0.05
％
‑
0.1
％
。
[0010]在其中一个实施例中，所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱
、
海藻糖
、BSA
和
Triton X
‑
100
中的二种或者二种以上
。
[0011]在其中一个实施例中，所述
PCR
反应增强剂包含甜菜碱和海藻糖
。
[0012]可选地，所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱和海藻糖
。
[0013]可选地，所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱
、
海藻糖和
BSA。
[0014]优选地，所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱
、
海藻糖
、BSA
和
Triton X
‑
100。
[0015]所述的
PCR
预混反应液在制备亚硫酸氢盐转化后
DNA
扩增的产品中的应用
。
[0016]一种用于亚硫酸氢盐转化后
DNA
扩增的
PCR
试剂盒，包括所述的
PCR
预混反应液
。
[0017]一种使用上述的
PCR
预混反应液或上述的试剂盒的亚硫酸氢盐转化后
DNA
扩增方法
。
[0018]本申请具备如下有益效果：
[0019]本申请提供的
PCR
预混反应液
、
试剂盒是通过在含有基本成分的
PCR
预混反应液中加入特定浓度的
PCR
反应增强剂，可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
PCR
预混反应液，其特征在于，所述
PCR
预混反应液包含如下组分：
5mM
‑
80mM Tris
‑
HCl、1mM
‑
4mM MgCl2、10mM
‑
250mM KCl、10mM
‑
80mM(NH4)2SO4和
PCR
反应增强剂；所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱
、
海藻糖
、BSA
和
Triton X
‑
100
中的一种或者多种；其中，所述
TMSO
在所述
PCR
预混反应液中的用量为
0.5M
‑
1M
；所述
TMAC
在所述
PCR
预混反应液中的用量为
20mM
‑
40mM
；所述甜菜碱在所述
PCR
预混反应液中的用量为
1.5M
‑
3M
；所述海藻糖在所述
PCR
预混反应液中的用量为
0.1M
‑
0.2M
；所述
BSA
在所述
PCR
预混反应液中的用量为
0.13mg/mL
‑
0.25mg/mL
；所述
Triton X
‑
100
在所述
PCR
预混反应液中的用量为
0.05
％
‑
0.1
％
(v/v)。2.
根据权利要求1所述的
PCR
预混反应液，其特征在于，所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱
、
海藻糖
、BSA
和
Triton X
‑
100
中的二种或者二种以上
。3.
根据权利要求2所述的
PCR
预混反应液，其特征在于，所述
PCR
反应增强剂包含甜菜碱和海藻糖；可选地，所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱和海藻糖；可选地，所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱
、
海藻糖和
BSA
；可选地，所述
PCR
反应增强剂包含
TMSO、TMAC、
甜菜碱
、
海藻糖
、BSA
和
Triton X
‑
100。4.
根据权利要求1～3任一项所述的
PCR
预混反应液，其特征在于，所述
PCR

【专利技术属性】
技术研发人员：孙帆，李婷婷，洪瑶，刘严，刘成杰，李肖燕，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：