一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种HCC治疗靶点的发现方法


[0001]本专利技术属于肝癌领域，具体地说，涉及一种
HCC
治疗靶点的发现方法
。

技术介绍

[0002]我国每年约有
46
万例肝癌新发病例，造成约
38
万人死亡，占全球肝癌死亡人数的一半，一般来说，癌症根据其组织起源可分为原发性肝癌和转移性肝癌，原发性癌症包括肝细胞癌
(Hepatocellular carcinoma
，
HCC)、
胆管癌和其他罕见类型的癌症，其中，
HCC
是最常见的原发性癌症类型，占所有原发性肝癌的
90
％以上
。
[0003]HCC
的发生因患者的潜在病因而异，但通常的顺序是肝损伤
、
慢性炎症
、
纤维化
、
肝硬化和肝癌，
HCC
在疾病早期几乎没有明显症状，一旦发现，几乎所有患者都处于中晚期，治疗困难，目前，世界上
HCC
患者的5年生存率仅为
20
％，早期症状隐蔽
、
治疗后复发和转移是癌症治疗效果和预后不佳的主要原因，因此，研究
HCC
的发生和发展，探索新的预后指标和治疗靶点，对于提高
HCC
的临床治疗效果具有重要意义
。
[0004]有鉴于此特提出本专利技术
。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种
HCC
治疗靶点的发现方法，解决了现有技术中的技术问题
。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用技术方案的基本构思是：
[0007]一种
HCC
治疗靶点的发现方法，包括：
[0008]步骤一：阐明
FBXW8
对
AZGP1
的分子精细调控机制，确定
FBXW8
对
PPT1
泛素化的影响，寻找调控
AZGP1
泛素化的磷酸化位点；
293T
细胞转染
GFP
标签的
PPT1
，同时分别共转
Flag
标签的
F
‑
box
蛋白，收样前6小时加入
MG132
，
Flag
抗体免疫沉淀，
western blot
检测沉淀物中是否含有
PPT1
，确定
PPT1
是否只与
FBXW8
互作；
293T
细胞转染
GFP
标签的
PPT1
，同时分别共转
Flag
标签的
F
‑
box
蛋白，
western blot
检测
PPT1
含量，确定
PPT1
是否只受
FBXW8
降解；
293T
细胞共转
pEGFP
‑
PPT1
，
pBABE
‑
Flag
‑
FBXW8
，
HA
‑
UB(
真核表达
HA
标签泛素的质粒
)
，收样前6小时加入
MG132
，
GFP
抗体免疫沉淀，
HA
抗体检测沉淀物中
UB
，确定
FBXW8
是否促进
PPT1
泛素化
。
[0009]步骤二：阐明
FBXW8
对
AZGP1
的分子精细调控机制，确定
FBXW8
对
PPT1
泛素化的影响，寻找调控
AZGP1
泛素化的磷酸化位点；进行截短体实验
(Mapping)
，把
PPT1
蛋白截成数个不同大小的小片段，分别与
FBXW8
共转
293t
细胞，免疫沉淀
FBXW8
后，
western blot
检测沉淀物中不同截短体是否存在；因
PPT1
蛋白较小，预计最小必须结构域中丝氨酸与苏氨酸位点不多，可将这些位点分别突变为丙氨酸，将这些突变体分别与
FBXW8
共转，检测与
FBXW8
互作是否消失；将突变体与
FBXW8
共转
293t
细胞，检测
FBXW8
降解作用是否消失，
PPT1
泛素化是否消失，构建谷氨酸突变体，检测其与
FBXW8
互作是否增强，半衰期缩短
。
[0010]步骤三：确定
FBXW8
‑
PPT1
轴与
HCC
影响；将常见
HCC
细胞系
Bel7402
，
HepG2
，
Huh7
，
HCCLM3
与正常肝细胞
LO2
等分六孔板，
RIPA
裂解后
BCA
定量，
western blot
检测
FBXW8
，
PPT1
蛋白表达水平，比较
HCC
相对于正常肝细胞，
PPT1
是否降低，
FBXW8
是否升高，
FBXW8
抗体购自
Invitrogen
，货号
PA5
‑
58565
，
PPT1
购自三鹰生物，货号
67699
‑1‑
Ig
；提取
Bel7402
，
HepG2
，
Huh7
，
HCCLM3
与
LO2
等细胞系总
RNA
，反转后
RT
‑
PCR
，
β
‑
actin
为内参
。
[0011]订购肝癌组织样本芯片，
HE
染色，免疫组化检测
FBXW8、PPT1
在癌与癌旁组织中的表达差异，分析二者表达水平与肿瘤
TNM
分期相关性，半定量免疫组化检测用于确定
FBXW8、PPT1
蛋白水平，在低倍镜下对细胞染色强度和染色细胞百分比进行评估，随机选取5个高倍视野进行观察，采用双盲法阅片，通过将强度分数与染色细胞阳性评分的程度相乘综合分析后确定最终的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
HCC
治疗靶点的发现方法，其特征在于，包括：步骤一：阐明
FBXW8
对
AZGP1
的分子精细调控机制，确定
FBXW8
对
PPT1
泛素化的影响，寻找调控
AZGP1
泛素化的磷酸化位点，并进入步骤二；步骤二：构建
FBXW8/AZGP41
稳定表达与敲除
HCC
细胞系，并进入步骤三；步骤三：确定
FBXW8
‑
PPT1
轴与
HCC
影响，并进入步骤四；步骤四：确定
FBXW8
‑
PPT1
轴对
HCC
恶性表型的影响，并进入步骤五；步骤五：阐明
FBXW8
‑
PPT1
轴对
HCC
发生发展影响的分子机制，并进入步骤六；步骤六：验证
FBXW8
‑
PPT1
轴在动物水平肝癌发生发展中的分子机制
。2.
根据权利要求1所述的一种
HCC
治疗靶点的发现方法，其特征在于，在步骤一中，
293T
细胞转染
GFP
标签的
PPT1
，同时分别共转
Flag
标签的
F
‑
box
蛋白，收样前6小时加入
MG132
，
Flag
抗体免疫沉淀，
western blot
检测沉淀物中是否含有
PPT1
，确定
PPT1
是否只与
FBXW8
互作；
293T
细胞转染
GFP
标签的
PPT1
，同时分别共转
Flag
标签的
F
‑
box
蛋白，
western blot
检测
PPT1
含量，确定
PPT1
是否只受
FBXW8
降解；
293T
细胞共转
pEGFP
‑
PPT1
，
pBABE
‑
Flag
‑
FBXW8
，
HA
‑
UB
，收样前6小时加入
MG132
，
GFP
抗体免疫沉淀，
HA
抗体检测沉淀物中
UB
，确定
FBXW8
是否促进
PPT1
泛素化
。3.
根据权利要求2所述的一种
HCC
治疗靶点的发现方法，其特征在于，在步骤二中，进行截短体实验，把
PPT1
蛋白截成数个不同大小的小片段，分别与
FBXW8
共转
293t
细胞，免疫沉淀
FBXW8
后，
western blot
检测沉淀物中不同截短体是否存在；因
PPT1
蛋白较小，预计最小必须结构域中丝氨酸与苏氨酸位点不多，可将这些位点分别突变为丙氨酸，将这些突变体分别与
FBXW8
共转，检测与
FBXW8
互作是否消失；将突变体与
FBXW8
共转
293t
细胞，检测
FBXW8
降解作用是否消失，
PPT1
泛素化是否消失，构建谷氨酸突变体，检测其与
FBXW8
互作是否增强，半衰期缩短
。4.
根据权利要求1所述的一种
HCC
治疗靶点的发现方法，其特征在于，在步骤三中，将常见
HCC
细胞系
Bel7402
，
HepG2
，
Huh7
，
HCCLM3
与正常肝细胞
LO2
等分六孔板，
RIPA
裂解后
BCA
定量，
western blot
检测
FBXW8
，
PPT1
蛋白表达水平，比较
HCC
相对于正常肝细胞，
PPT1
是否降低，
FBXW8
是否升高，
FBXW8
抗体购自
Invitrogen
，货号
PA5
‑
58565
，
PPT1
购自三鹰生物，货号
67699
‑1‑
Ig
；提取
Bel7402
，
HepG2
，
Huh7
，
HCCLM3
与
LO2
等细胞系总
RNA
，反转后
RT
‑
PCR
，
β
‑
actin
为内参
。5.
根据权利要求4所述的一种
HCC
治疗靶点的发现方法，其特征在于，在步骤三中，订购肝癌组织样本芯片，
HE
染色，免疫组化检测
FBXW8、PPT1
在癌与癌旁组织中的表达差异，分析二者表达水平与肿瘤
TNM
分期相关性，半定量免疫组化检测用于确定
FBXW8、PPT1
蛋白水平，在低倍镜下对细胞染色强度和染色细胞百分比进行评估，随机选取5个高倍视野进行观察，采用双盲法阅片，通过将强度分数与染色细胞阳性评分的程度相乘综合分析后确定最终的免疫反应评分，肝癌组织样本芯片购自上海威奥生物科技有限公司，肝癌及自体癌旁，详尽生化指标，
TNM
分期
、
带有复发资料，放化疗治疗，5年生存期
。6.
根据权利要求1所述的一种
HCC
治疗靶点的发现方法，其特征在于，在步骤四中，构建
Bel7402
，
HepG2
，
Huh7
，
HCCLM3d
的
HCC
细胞的
FBXW8/PPT1
稳定表达与敲除细胞系，稳定转染细胞系采用慢病毒感染方式构建，
pBABE
‑
Flag
‑
FBXW8/PPT1
与辅助质粒共转
293t
细胞，收病毒感染
HCC
细胞，嘌呤霉素筛选，
western bl...

【专利技术属性】
技术研发人员：李端琢，黄蜜，
申请(专利权)人：肇庆医学高等专科学校，
类型：发明
国别省市：