适用于构树不同组织荧光定量内参基因及其引物和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种构树

【技术实现步骤摘要】
适用于构树不同组织荧光定量内参基因及其引物和应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及适用于构树不同组织荧光定量内参基因及其引物和应用
。

技术介绍

[0002]构树
(Broussonetia papyrifera)
属于桑科
、
构树属，在中国黄河
、
长江流域均有分布，目前，中国种植的构树有
30
万公顷，被广泛应用于饲料
、
造纸和植被恢复等领域
。
构树中粗蛋白质含量可达
15
％
(
干物质基础
)
，高于禾本类粗饲料和普通豆科类粗饲料，与苜蓿干草中粗蛋白质含量基本相等
。
构树作为一种木本饲料，具有重大的开发价值
。
随着构树全基因组序列的公布，极大地促进了构树的分子生物学和遗传育种研究，但目前还没有用于构树不同组织基因功能验证相关研究的内参基因，常用的内参基因在不同的植物及实验条件下会表现不稳定的性状，从而影响目的基因检测的准确性，因此筛选在构树不同组织稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素
。

技术实现思路

[0003]针对现有技术中存在的不足，本专利技术目的在于提供适用于构树不同组织荧光定量内参基因，该基因能够满足实时荧光定量检测构树不同组织转录表达水平的要求，提高了构树不同组织基因表达分析研究的稳定性和可靠性
。
本专利技术的另一目的是提供一种上述内参基因的专用引物
。
本专利技术还有一目的是提供一种上述内参基因或专用引物的应用
。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0005]第一方面，本专利技术提供了
ACT
基因和
UBQ
基因组合在构树不同组织荧光定量中作为内参基因的应用，所述
ACT
基因的序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述
UBQ
基因的序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0006]进一步地，所述
ACT
基因的引物序列如下：
[0007]ACT
正向引物5’‑
AATGGTGAAGGCTGGGTT
‑3’
[0008]ACT
反向引物5’‑
ACCGTGCTCAATGGGATA
‑3’
。
[0009]进一步地，所述
UBQ
基因的引物序列如下：
[0010]UBQ
正向引物5’‑
CCCTCGCCGACTACAACA
‑3’
[0011]UBQ
反向引物5’‑
TCAGCCTCTGGACCTTGC
‑3’
。
[0012]进一步地，所述不同组织为构树叶片
、
叶柄
、
幼果
、
成熟果
、
茎
、
根
。
[0013]第二方面，本专利技术还提供了检测
ACT
基因和
UBQ
基因的引物组合在构树不同组织荧光定量中的应用，所述引物组合由以下引物组成：
[0014]ACT
正向引物5’‑
AATGGTGAAGGCTGGGTT
‑3’
[0015]ACT
反向引物5’‑
ACCGTGCTCAATGGGATA
‑3’
[0016]UBQ
正向引物5’‑
CCCTCGCCGACTACAACA
‑3’
[0017]UBQ
反向引物5’‑
TCAGCCTCTGGACCTTGC
‑3’
。
Synthesis SuperMix(Trans,NanJing,China)
说明书，使用1μ
g
总
RNA
建立
20
μ
L cDNA
逆转录反应体系
。
反应完成后存于
‑
20℃
备用
。
[0040]2、
内参基因的选择及引物的设计
[0041]根据文献查询其他植物中主要的内参基因并最终设计出实验所需的9个内参基因，分别为
ACT(SEQ ID NO.1)、UBQ(SEQ ID NO.2)、
α
‑
TUB1(SEQ ID NO.3)、
α
‑
TUB2(SEQ ID NO.4)、
β
‑
TUB(SEQ ID NO.5)、TIP41(SEQ ID NO.6)、CDC2(SEQ ID NO.7)、H2A(SEQ ID NO.8)、DnaJ(SEQ ID NO.9)。
[0042]首先在本申请人通过与构树基因组序列进行比对，确定各候选基因的全长序列和全长转录本序列，根据基因的转录全长序列用
Primer Premier 5.0
设计引物，通过
BLAST
工具鉴定引物特异性
。
引物均在生工生物工程股份有限公司合成
(
表
1)
，通过普通
PCR
初步筛选引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察
PCR
产物的条带，检测产物特异性
。
选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物，近一步通过
qRT
‑
PCR
进一步检测引物特异性，选择峰图单一，没有杂峰，阴性对照无峰的引物作为最终的引物
。
[0043]表1内参基因及其对应的引物
3、
内参基因引物标准曲线的建立
[0044]对每一对内参基因的引物制作各自的标准曲线，计算对应引物的扩增效率
。
将反转录的
cDNA
以5为倍数稀释成5个梯度
(1、1/5、1/25、1/125、1/625)
，作为建立标准曲线的模板
。
同时，以
ddH2O
作为阴性对照模板，来检测实验过程中的试剂或者人为污染
。
所有的样品均做3次重复，以确保实验数据的可信度
。
用
QIAquant 96 2plex(QIAGEN,Germany)
进行
qRT
‑
PCR
，利用得到的数据结果求得各候选基因的扩增效率及斜率，荧光定量
PCR
扩增效率要求所选引物的扩增效率在
90
％
‑
110
％之间
。
[0045]4、
荧光实时定量
[0046]使用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ACT
基因和
UBQ
基因组合在构树不同组织荧光定量中作为内参基因的应用，其特征在于，所述
ACT
基因的序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述
UBQ
基因的序列如
SEQ ID NO.2
所示
。2.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述
ACT
基因的引物序列如下：
ACT
正向引物5’‑
AATGGTGAAGGCTGGGTT
‑3’
ACT
反向引物5’‑
ACCGTGCTCAATGGGATA
‑3’
。3.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述
UBQ
基因的引物序列如下：
UBQ
正向引物5’‑
CCCTCGCCGACTACAACA
‑3’
UBQ
反向引物5’‑
TCAGCCTCTGGACCTTGC
‑3’
。4.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述不同组织为构树叶片
、
叶柄
、
幼果
、
成熟果
、
茎
、
根
。5.
检测
ACT
基因和
UBQ
基因的引物组合在构树不同组织荧光定量中的应用，其特征在于，所述引物组合由以下引物组成：
ACT
正向引物5’‑
AATGGTGAAGGCTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：周芳伟，杨少宗，徐梁，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：