一种快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的制造技术

本发明专利技术提出了一种快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的

【技术实现步骤摘要】
一种快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的HPLC方法


[0001]本专利技术涉及药物分析
，特别涉及一种快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的
HPLC
方法
。

技术介绍

[0002]他克莫司
(Tacrolimus
，
FK506)
是从一种土壤中分离的筑波链霉菌发酵液中提取得到的一种中性
、
疏水性大环内酯类新型强效免疫抑制剂，其药效是传统免疫剂环孢素
A
的
10
～
100
倍，临床应用于预防肝脏或肾脏移植的排斥防治，现作为预防治疗排斥反应以及自身免疫性疾病的一线药物
。
[0003]子囊霉素
(Ascomycin
，
FK520)
是发酵生产他克莫司发酵液过程中产生的副产物，是多种新药物的中间体
。
为了保证他克莫司提取纯化后续工艺的顺利进行和控制产品质量，需要对他克莫司发酵过程中产生的副产物子囊霉素的含量进行控制
。
因此，研究一种能快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的检测方法，对原料药生产企业中间过程控制显得非常必要
。
[0004]通过查阅文献及专利，目前针对他克莫司发酵液中他克莫司和子囊霉素及其他杂质的分离测定方法较少，且方法大多只集中在他克莫司主成分的检测上，能快速同时测定他克莫司发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的方法未见报道，此状况不利于企业对产品质量的把控，所以亟需一种有效的能同时快速测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的分析方法
。

技术实现思路

[0005]本专利技术提出了一种快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的
HPLC
方法，解决了现有技术缺少能快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的检测方法的缺陷
。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]一种快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的
HPLC
方法，通过反相液相色谱进行测定，色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱，流动相包括流动相
A
和流动相
B
，流动相
A
包括水
﹑
无机酸和有机溶剂，流动相
B
包括有机相溶剂，按体积分数设置等度洗脱，以及采用外标法进行定量分析
。
[0008]进一步地，还包括检测前溶液的制备，溶液包括：
[0009]空白溶液，包括稀释剂；
[0010]试品溶液，包括他克莫司发酵液和稀释剂；
[0011]他克莫司标准曲线工作溶液，包括他克莫司标准品和稀释剂；
[0012]子囊霉素标准曲线工作溶液，包括子囊霉素标准品和稀释剂
。
[0013]进一步地，包括以下步骤：
[0014]A1、
流动相
A
的配制
[0015]量取一定量的无机酸，加水稀释
、
混匀，配制成无机酸溶液，再加入有机溶剂，混匀；
[0016]A2、
试品溶液的配制
[0017]称取一定量的他克莫司发酵液，加入稀释剂振荡溶解，并定容，再经过过滤得到试品溶液；
[0018]A3、
他克莫司标准曲线工作溶液和子囊霉素标准曲线工作溶液的配制
[0019]称取一定量的他克莫司标准品，加入稀释剂，制成他克莫司标准储备液，再量取他克莫司标准储备液，配制成系列的他克莫司标准曲线工作溶液；
[0020]称取一定量的子囊霉素标准品，加入稀释剂，制成子囊霉素标准储备液，再量取子囊霉素标准储备液，配制成系列的子囊霉素标准曲线工作溶液；
[0021]A4、
检测分析
[0022]采用带紫外检测器的高效液相色谱仪，外标法定量；
[0023]带紫外检测器的高效液相色谱仪选用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱，流动相
A
与流动相
B
的体积比为
58:42
至
75:25
，色谱柱的流速为
0.7
～
1.3mL/min
，色谱柱的柱温为
30
～
60℃
，色谱柱的进样量为5～
20
μ
L
，检测波长为
205
～
230nm
；
[0024]A5、
结果计算
[0025]分别将配制好的他克莫司标准曲线工作溶液和子囊霉素标准曲线工作溶液，按浓度由低到高的顺序进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，绘制标准曲线，曲线的线性相关系数
R2≥0.999
；
[0026]将过滤后的试样溶液注入采用带紫外检测器的高效液相色谱仪中，得到相应的峰面积，依据标准曲线得到待测液中他克莫司和子囊霉素的浓度
。
[0027]进一步地，包括以下步骤：
[0028]A1、
流动相
A
的配制
[0029]量取
1.0mL
无机酸，加水至
1000mL
，混匀，配制成浓度为
0.1
％的无机酸溶液，再加入
50mL
有机溶剂，混匀；
[0030]A2、
试品溶液的配制
[0031]称取
5.0g
他克莫司发酵液于
100mL
容量瓶中，加入
50mL
稀释剂振荡
30
分钟，溶解后定容，上清液经
0.22
μ
m
的有机微孔膜过滤，得到试品溶液；
[0032]A3、
他克莫司标准曲线工作溶液和子囊霉素标准曲线工作溶液的配制
[0033]称取
10mg
的他克莫司标准品，用稀释剂溶解并定容至
10mL
，配制成含量为
1000mg/L
的他克莫司标准储备液，于2～
8℃
下保存；再分别吸取适量他克莫司标准储备液，用稀释剂配制成
5﹑10﹑50﹑150﹑300﹑600mg/L
的他克莫司标准曲线工作溶液，于2～
8℃
下保存，现用现配；
[0034]精密称取
10mg
的子囊霉素标准品，用稀释剂溶解并定容至
10mL
，配制成含量为
1000mg/L
的子囊霉素标准储备液，于2～
8℃
下保存；再分别吸取适量子囊霉素标准储备液，用稀释剂配制成
5﹑10﹑50﹑100﹑200﹑400mg/L
的子囊霉素标准曲线工作溶液，于2～
8℃
下保存，现用现配；
[0035]A4、
检测分析
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的
HPLC
方法，其特征在于：通过反相液相色谱进行测定，色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱，流动相包括流动相
A
和流动相
B
，流动相
A
包括水
﹑
无机酸和有机溶剂，流动相
B
包括有机相溶剂，按体积分数设置等度洗脱，以及采用外标法进行定量分析
。2.
据权利要求1所述的快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的
HPLC
方法，其特征在于：还包括检测前溶液的制备，溶液包括：空白溶液，包括稀释剂；试品溶液，包括他克莫司发酵液和稀释剂；他克莫司标准曲线工作溶液，包括他克莫司标准品和稀释剂；子囊霉素标准曲线工作溶液，包括子囊霉素标准品和稀释剂
。3.
据权利要求2所述的快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的
HPLC
方法，其特征在于：包括以下步骤：
A1、
流动相
A
的配制量取一定量的无机酸，加水稀释
、
混匀，配制成无机酸溶液，再加入有机溶剂，混匀；
A2、
试品溶液的配制称取一定量的他克莫司发酵液，加入稀释剂振荡溶解，并定容，再经过过滤得到试品溶液；
A3、
他克莫司标准曲线工作溶液和子囊霉素标准曲线工作溶液的配制称取一定量的他克莫司标准品，加入稀释剂，制成他克莫司标准储备液，再量取他克莫司标准储备液，配制成系列的他克莫司标准曲线工作溶液；称取一定量的子囊霉素标准品，加入稀释剂，制成子囊霉素标准储备液，再量取子囊霉素标准储备液，配制成系列的子囊霉素标准曲线工作溶液；
A4、
检测分析采用带紫外检测器的高效液相色谱仪，外标法定量；带紫外检测器的高效液相色谱仪选用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱，流动相
A
与流动相
B
的体积比为
58:42
至
75:25
，色谱柱的流速为
0.7
～
1.3mL/min
，色谱柱的柱温为
30
～
60℃
，色谱柱的进样量为5～
20
μ
L
，检测波长为
205
～
230nm
；
A5、
结果计算分别将配制好的他克莫司标准曲线工作溶液和子囊霉素标准曲线工作溶液，按浓度由低到高的顺序进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，绘制标准曲线，曲线的线性相关系数
R2≥0.999
；将过滤后的试样溶液注入采用带紫外检测器的高效液相色谱仪中，得到相应的峰面积，依据标准曲线得到待测液中他克莫司和子囊霉素的浓度
。4.
据权利要求3所述的快速同时测定发酵液中他克莫司和子囊霉素含量的
HPLC
方法，其特征在于：包括以下步骤：
A1、
流动相
A
的配制量取
1.0mL
无机酸，加水至
1000mL
，混匀，配制成浓度为
0.1
％的无机酸溶液，再加入
50mL
有机溶剂，混匀；
A2、
试品溶液的配制
称取
5.0g
他克莫司发酵液于
100mL
容量瓶中，加入
50mL
稀释剂振荡
30
分钟，溶解后定容，上清液经
0.22
μ
m
的有机微孔膜过滤，得到试品溶液；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂华，吴燕强，蒋永飞，
申请(专利权)人：广东新达瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：