一种单分子均相发光检测系统及检测方法技术方案

本发明专利技术公开了一种单分子均相发光检测系统及检测方法，属于蛋白检测技术领域，单分子均相发光检测系统，包括：聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片；磁控操作平台；长余辉检测探针；以及旋转磁场

【技术实现步骤摘要】
一种单分子均相发光检测系统及检测方法


[0001]本专利技术涉及蛋白检测
，具体涉及一种单分子均相发光检测系统及检测方法
。

技术介绍

[0002]感染性疾病
、
癌症
、
心肌梗死以及阿尔兹海默病等疾病早期的靶标蛋白丰度过低，传统酶联免疫吸附实验
(enzyme
‑
linked immunosorbent assay
，
ELISA)
只能提供皮摩水平
(10
‑
12
M)
的检测限，难以满足这些疾病早期诊断的需求，同时也限制了更多蛋白检测标志物的发掘与运用
。
为了进一步提高蛋白检测的灵敏度以提高对疾病进展和转归的理解，近年来，基于单分子检测的技术平台被开发用于蛋白的超灵敏检测
。
[0003]例如，数字
ELISA(digital ELISA,dELISA)
技术是近些年发展的单分子蛋白检测技术，其原理类似于数字聚合酶链反应技术
(digital polymerase chain reaction
，
dPCR)。Single MoleculeArrays(SiMoAs)
是当前超灵敏蛋白检测的金标准方法
。SiMoAs
是一个基于微孔阵列的
dELISA
技术，该方法通过使用远多于靶标物质数量的包被有捕获抗体的磁珠实现珠子结合单个靶标分子或不结合靶标分子的目的r/>。
被珠子捕获了的单个蛋白分子进一步与生物素标记的检测抗体以及链霉亲和素连接的酶结合形成三明治夹心复合物
,
形成的免疫复合物与酶底物混合后被分离到只能装载一个珠子大小的孔中
。
将微孔阵列进行油封处理后，载有单个酶标记的免疫复合物会产生高浓度的荧光产物并局限在约
50
飞升的孔中
。
通过对微孔阵列进行荧光成像区分阳性微孔
(
结合单个酶分子的珠子
)
和阴性微孔，计数同时含有珠子和荧光产物的孔数相对于含有珠子的孔的总数确定测试样品中的蛋白质浓度
。
[0004]但是，
SiMoAs
技术对飞升大小的微孔阵列芯片的加工精度要求高，操作流程较为繁琐
。
[0005]SMCxPRO
免疫平台将传统
ELISA
检测流程和单分子计数
(Single Molecule Counting
，
SMC)
技术结合用于单分子检测
。
先基于传统
ELISA
操作流程形成夹心复合物，即用微孔板或珠子捕获样本中的蛋白分子，再与标记有荧光分子的检测抗体结合形成夹心复合物
。SMC
技术的专有洗脱步骤将荧光标记的检测抗体从上述夹心复合物中解离出来，随后，将洗脱液转移到
384
孔板
。
再将
384
孔板放入
SMCxPRO
仪器中，当激光通过狭窄的检测窗口时，激光会激发荧光标记的检测抗体，光电二极管捕获单个光子并记录信号完成单个分子的数字定量
。
[0006]但是，该技术检测通量有限；对检测荧光信号的光学系统要求高；检测流程并不是完全自动化，即便与其他模块结合实现自动化操作，但同时也增加了实验成本
。
[0007]基于此，本专利技术设计了一种单分子均相发光检测系统及检测方法以解决上述问题
。

技术实现思路

[0008]针对现有技术所存在的上述缺点，本专利技术提供了一种单分子均相发光检测系统及检测方法
。
[0009]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0010]一种单分子均相发光检测系统，包括：
[0011]聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片；
[0012]磁控操作平台；
[0013]长余辉检测探针；
[0014]以及旋转磁场
、
梯度磁场
、
震荡分散磁场和集群离散磁场
。
[0015]本专利技术还公开了一种单分子均相发光检测方法，包括以下步骤：
[0016]一
、
制备聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片；
[0017]二
、
搭建磁控操作平台；
[0018]三
、
制备长余辉检测探针；
[0019]四
、
磁场辅助均相发光的单分子检测芯片检测肌钙蛋白，包括以下步骤：
[0020](1)
将待测样本与偶联了抗肌钙蛋白抗体的磁珠混合，并加入聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的孵育池中；
[0021](2)
施加旋转磁场以增强肌钙蛋白与磁珠的结合，随后向孵育池中加入长余辉检测探针，在旋转磁场作用下进一步促进夹心免疫复合物的接触和形成；
[0022](3)
施加梯度磁场操控磁珠从孵育池穿梭到聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的清洗池，随后通过施加震荡分散磁场去除非特异性结合的分子；
[0023](4)
施加梯度磁场操控磁珠从清洗池穿梭到聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的检测池，在集群离散磁场作用下实现夹心免疫复合物的空间均匀分布；长余辉检测探针的长余辉材料受到激发后，在规定时间进行余晖定量，从而实现肌钙蛋白的单分子检测
。
[0024]更进一步的，步骤一
、
制备聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片，具体包括以下步骤：
[0025](1)
基底准备：把硅烷化处理后的硅片浸在剥离溶液中，将硅片转移到去离子水中清洗；把硅片放到旋转漂洗烘干机中干燥，随后将硅片完全干燥；
[0026](2)
光刻胶的旋涂和软烘：把硅片放到匀胶机中，将光刻胶倒在硅片中心，在硅片上旋涂光刻胶；将旋涂了光刻胶的硅片软烘；
[0027](3)
光刻胶的曝光和后烘：在硅片上添加掩膜，使用紫外光对光刻胶进行曝光处理；曝光处理后，将硅片烘焙；
[0028](4)
显影
、
漂洗以及干燥：将硅片放在显影液中，用异丙醇喷洗显影硅片后，使用氮气吹干硅片；得到含有孵育池
、
清洗池和检测池设计的模具；
[0029](5)
在基板上铸造
PDMS
复刻物：将
PDMS
预聚物和固化剂混合，并充分搅拌，真空排气，然后倒在模具上，再次排气，烘焙；将
PDMS
复刻物从模具上剥离，切割
PDMS
复刻物，并在上面进行打孔；
[0030](6)PDMS
复刻物与玻璃的键合：用压敏胶清洁
PDMS
，用氧等离子体处理
PDMS
和玻璃表面；将
PDMS...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种单分子均相发光检测系统，其特征在于，包括：聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片；磁控操作平台；长余辉检测探针；以及旋转磁场
、
梯度磁场
、
震荡分散磁场和集群离散磁场
。2.
一种单分子均相发光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：一
、
制备聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片；二
、
搭建磁控操作平台；三
、
制备长余辉检测探针；四
、
磁场辅助均相发光的单分子检测芯片检测肌钙蛋白，包括以下步骤：
(1)
将待测样本与偶联了抗肌钙蛋白抗体的磁珠混合，并加入聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的孵育池中；
(2)
施加旋转磁场以增强肌钙蛋白与磁珠的结合，随后向孵育池中加入长余辉检测探针，在旋转磁场作用下进一步促进夹心免疫复合物的接触和形成；
(3)
施加梯度磁场操控磁珠从孵育池穿梭到聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的清洗池，随后通过施加震荡分散磁场去除非特异性结合的分子；
(4)
施加梯度磁场操控磁珠从清洗池穿梭到聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的检测池，在集群离散磁场作用下实现夹心免疫复合物的空间均匀分布；长余辉检测探针的长余辉材料受到激发后，在规定时间进行余晖定量，从而实现肌钙蛋白的单分子检测
。3.
根据权利要求2所述的单分子均相发光检测方法，其特征在于，步骤一
、
制备聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片，具体包括以下步骤：
(1)
基底准备：把硅烷化处理后的硅片浸在剥离溶液中，将硅片转移到去离子水中清洗；把硅片放到旋转漂洗烘干机中干燥，随后将硅片完全干燥；
(2)
光刻胶的旋涂和软烘：把硅片放到匀胶机中，将光刻胶倒在硅片中心，在硅片上旋涂光刻胶；将旋涂了光刻胶的硅片软烘；
(3)
光刻胶的曝光和后烘：在硅片上添加掩膜，使用紫外光对光刻胶进行曝光处理；曝光处理后，将硅片烘焙；
(4)
显影
、
漂洗以及干燥：将硅片放在显影液中，用异丙醇喷洗显影硅片后，使用氮气吹干硅片；得到含有孵育池
、
清洗池和检测池设计的模具；
(5)
在基板上铸造
PDMS
复刻物：将
PDMS
预聚物和固化剂混合，并充分搅拌，真空排气，然后倒在模具上，再次排气，烘焙；将
PDMS
复刻物从模具上剥离，切割
PDMS
复刻物，并在上面进行打孔；
(6)PDMS
复刻物与玻璃的键合：用压敏胶清洁
PDMS
，用氧等离子体处理
PDMS
和玻璃表面；将
PDMS
和玻璃表面键合形成密闭的
PDMS
微流控设备；在模具的孵育池
、
清洗池以及检测池之间填充油相，物理隔离三个区域
。4.
根据权利要求3所述的单分子均相发光检测方法，其特征在于，步骤一中，
(2)
光刻胶的旋涂和软烘：把硅片放到匀胶机中，将光刻胶倒在硅片中心，在硅片上旋涂光刻胶；将旋涂了光刻胶的硅片分别在
65℃
和
95℃
条件下软烘
3min<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭劲宏，王勇，尚美云，
申请(专利权)人：重庆医科大学绍兴柯桥医学检验技术研究中心，
类型：发明
国别省市：