一种胱硫醚-γ-合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种高活性胱硫醚

【技术实现步骤摘要】
一种胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体及其应用


：
[0001]本专利技术涉及一种高活性胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体及其应用，属于代谢工程领域
。

技术介绍

：
[0002]L
‑
蛋氨酸，又称“L
‑
甲硫氨酸”，是八种必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，与
L
‑
苏氨酸
、L
‑
异亮氨酸和
L
‑
赖氨酸同属于天冬氨酸家族氨基酸
。L
‑
甲硫氨酸在许多机体功能中扮演了极其重要角色
。
除了其在蛋白质生物合成中起作用以外，也可参与甲基的转移
、
磷的代谢以及硒和锌的生物利用
。L
‑
甲硫氨酸也可被直接用于治疗医学疾病，如过敏和风湿热
。
但
L
‑
甲硫氨酸在高等动物体内无法自身合成，需从外界摄取
。
如今，工业生产的
L
‑
甲硫氨酸大多数被添加至动物饲料中，以促进动物生长繁殖，降低生产成本
。
正是由于
L
‑
甲硫氨酸及其衍生物特殊的生物
、
化学活性，使其被广泛应用于食品
、
医药
、
农业
、
化妆品以及饲料添加等行业
。
目前
L<br/>‑
甲硫氨酸主要通过化学法合成，但是存在合成原料有毒，能耗高，反应条件苛刻，提取过程复杂以及污染环境等问题
。
相比之下，微生物发酵法生产成本低，条件温和，并且绿色环保，近年来该法被广泛应用于生产各种氨基酸
。
[0003]在
L
‑
甲硫氨酸生物合成途径中，
metB
编码的胱硫醚
‑
γ
‑
合酶是关键酶
。
该酶催化
L
‑
半胱氨酸和
O
‑
琥珀酰
‑
高丝氨酸生成胱硫醚和琥珀酸
。
胱硫醚在
β
‑
胱硫醚酶作用下形成
L
‑
高半胱氨酸，接着
L
‑
高半胱氨酸在高半胱氨酸甲基转移酶催化下形成
L
‑
甲硫氨酸
。
胱硫醚
‑
γ
‑
合酶活性不足在很大程度上限制了
L
‑
甲硫氨酸高效合成
。

技术实现思路

：
[0004]为了克服胱硫醚
‑
γ
‑
合酶活性低引起的
L
‑
甲硫氨酸合成效率低等不足的问题，本专利技术将提供一种高活性胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体，并将该酶应用于
L
‑
甲硫氨酸生物合成
。
[0005]本专利技术解决上述问题的技术方案之一是：提供一种高活性胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体
MetB
M
，氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体
MetB
M
是在
SEQ ID NO.3
所示的大肠杆菌
(Escherichia coli)W3110
来源的野生型胱硫醚
‑
γ
‑
合酶的基础上发生
Q5R、F87I、E136G、V231E、F321V
及
A346T
突变获得
。
[0006]本专利技术提供的技术方案之二，是所述胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体
MetB
M
的编码基因；
[0007]进一步地，所述胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体的编码基因为
metB
M
，核苷酸序列如序列表
SEQ ID NO.2
所示
。
[0008]本专利技术提供的技术方案之三，是所述胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体
MetB
M
的应用，特别是在生产
L
‑
甲硫氨酸中的应用
。
[0009]有益效果：
[0010]本专利技术所述
metB
M
基因编码的胱硫醚
‑
γ
‑
合酶
MetB
M
具有如下特点：该酶
Km
和
Kcat
分别为
0.13mmol/L
和
138.2s
‑1，
Kcat/Km
为
1063.1(mmol/L)
‑1S
‑1，比活力为
195.3U/mg。
底物结合效率及酶活力均高于野生型
MetB。
附图说明
：
[0011]图1高活性胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体筛选原理示意图；
[0012]图2菌株生物量
。
具体实施方式
：
[0013]为了使本专利的目的
、
技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明
。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术
。
[0014]本专利技术中，所述突变体
MetB
M
筛选过程如下：
[0015]利用易错
PCR
获得胱硫醚
‑
γ
‑
合酶编码基因
metB
突变体库，将其连接至
pUC19
，获得含
metB
突变体的重组质粒库
(
命名为
pUC
‑
metBs)。
然后以大肠杆菌
Escherichia coli W3110
为出发菌株，依次敲除其胱硫醚
‑
γ
‑
合酶编码基因
metB
及琥珀酰
‑
CoA
编码基因
sucCD(
获得菌株
MET02)。
将
pUC
‑
metBs
库转化至
MET02
，涂布于固体筛选培养基
。
挑选较大的菌落本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体，其特征在于，所述胱硫醚
‑
γ
‑
合酶氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。2.
权利要求1所述胱硫醚
‑
γ
‑
合酶突变体的编码基因
。3.
权利要求2所述的编码基因，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成林，闫倩玉，芦楠，孙浩，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：