靶向制造技术

本申请涉及一种靶向

【技术实现步骤摘要】
靶向C12orf40基因的核酸组合物、非梗阻性无精子症动物模型的制备方法及应用


[0001]本申请属于生物
，特别涉及一种靶向
C12orf40
基因的核酸组合物
、
非梗阻性无精子症动物模型的制备方法及应用
。

技术介绍

[0002]研究表明睾丸特异性高表达的基因发生功能缺陷是导致男性不育的重要原因，如
TEX11、SHOC1、MEIOB
等睾丸特异性高表达的基因，其功能缺失可导致人类和小鼠睾丸精子发生阻滞进而表现为非梗阻性无精子症
(non
‑
obstruction azoospermia
，
NOA)
，其是男性不育最严重的一种表型，研究并建立非梗阻性无精子症的动物模型为探明疾病病因
、
发病机制和治疗药物开发具有重要意义
。
[0003]目前基于基因编辑技术构建特定靶基因敲除或敲入小鼠是目前研究靶基因功能的主流方法
。
同源重组技术
(homologous recombination,HR)
是最早的基因编辑技术，也是真核生物基因编辑的一个重大突破
。
其原理是将外源性目的基因导入受体细胞，通过同源序列交换，使外源性
DNA
片段取代原位点上的基因，从而达到使特定基因失活或修复缺陷基因的目的
。
但是对高等真核生物来说，外源
DNA
与目的
DNA
自然重组率非常低，只有
1/107—1/106，因此
HR
的大规模应用受到了一定的限制
。
[0004]由此，目前亟需有效的构建非梗阻性无精子症动物模型的方法
。

技术实现思路

[0005]基于此，本申请设计了简单有效的方式，利用
Crispr
‑
Cas
系统快速敲除
C12orf40
基因，构建该疾病的动物模型
Crispr
‑
Cas
系统能够在第一
sgRNA
和第二
sgRNA
的指引下在精准切割
DNA
造成双链断裂，基因组中的
C12orf40
基因的第四外显子特定片段
DNA
能够被切除，但在
DNA
双链修复时，发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使
C12orf40
基因失去功能，从而实现基因敲除
。
[0006]本申请的具体方案如下：
[0007]本申请的一方面提供一种靶向
C12orf40
基因的核酸组合物，所述核酸组合物包括第一
sgRNA
和第二
sgRNA
，其核苷酸序列分别如
SEQ ID NO.1
和
SEQ ID NO.2
所示
。
[0008]本申请另一方面提供一种靶向
C12orf40
基因的基因功能失活试剂盒，所述试剂盒包括如上述的核酸组合物
。
[0009]本申请还提供一种非梗阻性无精子症动物模型的制备方法，包括以下步骤：使用
Crispr
‑
Cas
系统编辑目标动物的
C12orf40
基因使其功能失活，制备非梗阻性无精子症动物模型；
[0010]其中所述
Crispr
‑
Cas
系统包括如上述的核酸组合物和
Cas9
酶
。
[0011]在其中一个实施例中，所述
Crispr
‑
Cas
系统处理的对象为所述目标动物的受精卵
。
[0012]在其中一个实施例中，所述
Crispr
‑
Cas
系统以所述核酸组合物和
Cas9mRNA
的形式转入所述受精卵
。
[0013]在其中一个实施例中，所述
Crispr
‑
Cas
系统转入所述受精卵的方法为显微注射
。
[0014]在其中一个实施例中，所述制备方法还包括将转入所述
Crispr
‑
Cas
系统的受精卵移植到假孕雌性动物体内并产出
F0
代；
[0015]将所述
F0
代与野生型进行交配，获得
F1
代杂合子，将
F1
代杂合子进行自交，获得纯合的
F2
代
。
[0016]在其中一个实施例中，所述目标动物为小鼠或大鼠
。
[0017]在其中一个实施例中，所述目标动物为小鼠，所述制备方法还包括对小鼠进行基因型鉴定的步骤：以小鼠脚趾提取到的基因组
DNA
为模板，以
SEQ ID NO.3
和
SEQ ID NO.4
为引物，
PCR
扩增后，电泳法鉴定小鼠的
C12orf40
基因型
。
[0018]基于上述技术方案，本申请具有以下有益效果：
[0019]本申请设计的靶向
C12orf40
基因的核酸组合物通过验证能够对
C12orf40
基因的第四号外显子高效且快速敲除和敲入，测序结果证实了小鼠体内
C12orf40
基因的敲除
。
其中，第一
sgRNA
和第二
sgRNA
序列在待改变的
C12orf40
基因上的靶序列上是唯一的
。
[0020]由该方法获得的
C12orf40
基因敲除小鼠作为研究精子发生障碍且阻滞发生在减数分裂阶段的非梗阻性无精子症动物模型，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并进一步开发针对该疾病的治疗方式
。
[0021]本申请还提供一种筛选或鉴定用于治疗非梗阻性无精子症的药物的方法，使用如上述的核酸组合物
、
上述的试剂盒或上述的非梗阻性无精子症动物模型的制备方法制得的非梗阻性无精子症动物模型，筛选或鉴定用于治疗非梗阻性无精子症的药物
。
附图说明
[0022]图1为实施例1中利用
Crispr
‑
Cas
系统构建了
C12orf40
基因敲除小鼠结果图；
[0023]图2为实施例1中
C12orf40
基因敲除雄鼠表现为雄性不育伴非梗阻性无精子症表型结果图
。
具体实施方式
[0024]为了便于理解本申请，下面将参照实施例对本申请进行更全面的描述，以下给出了本申请的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种靶向
C12orf40
基因的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括第一
sgRNA
和第二
sgRNA
，其核苷酸序列分别如
SEQ ID NO.1
和
SEQ ID NO.2
所示
。2.
一种靶向
C12orf40
基因的基因功能失活试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的核酸组合物
。3.
非梗阻性无精子症动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：使用
Crispr
‑
Cas
系统编辑目标动物的
C12orf40
基因使其功能失活，制备非梗阻性无精子症动物模型；其中所述
Crispr
‑
Cas
系统包括如权利要求1所述的核酸组合物和
Cas9
酶
。4.
根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述
Crispr
‑
Cas
系统处理的对象为所述目标动物的受精卵
。5.
根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述
Crispr
‑
Cas
系统以所述核酸组合物和
Cas9 mRNA
的形式转入所述受精卵
。6.
根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂超峰，谭跃球，王韦力，蒙岚岚，谭琛，粟丽兰，易思兵，张前军，张欢，聂洪川，
申请(专利权)人：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司，
类型：发明
国别省市：