一种无筛选标签质粒系统及生产方式技术方案

本文提供了可用于制备无筛选标签质粒的前体质粒，其包括：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种无筛选标签质粒系统及生产方式


[0001]本文涉及质粒，尤其是用于制备无筛选标签质粒的前体质粒
。
本文还涉及所述无筛选标签质粒的制备方法及制备无筛选标签质粒的试剂盒
。

技术介绍

[0002]近年来，基因和细胞治疗技术正逐渐成为治疗人类疾病的新的重要方法
。
安全高效的
DNA
递送载体能使基因和细胞治疗在未来人类疾病的预防和治疗中发挥更大的作用
。
过去二十年中，基于质粒载体的非病毒递送体系和基于质粒的病毒包装
/
递送系统在基因缺陷修复
、
疾病治疗和预防等方面受到广泛关注
。
提高质粒的安全性
、
稳定性和产量，降低细胞毒性一直是质粒在基因和细胞治疗领域的重点研究方向
。
[0003]用于基因治疗的质粒
DNA
分子通常具有模块化的结构，包括一个真核转录单元和一个原核复制单元
。
常规质粒除
DNA
复制所需的序列外，为了确保克隆过程中便于阳性克隆筛选和稳定遗传，通常携带至少一个抗生素药物抗性基因
。
常用的筛选标签包括氨苄青霉素
、
卡那霉素
、
氯霉素
、
新霉素
、
四环素等
[1]。
然而当应用于基因治疗时，质粒
DNA
可能被存在于呼吸道或消化道表面的细菌吸收，质粒上携带的抗生素抗性基因可能会造成病人产生抗生素耐药性等副作用，因此促使了对无抗生素抗性标签质粒的开发
。
[0004]目前应用较为广泛的无抗生素抗性标签的质粒主要有以下几种：
1)Minicircles(
环状
DNA
分子
)。Minicircle
通过含有重组位点的常规质粒在
E.coli
体内发生自身重组形成一个仅包含目的序列的环状
DNA
分子和一个具有复制能力的包含抗生素抗性基因的小质粒
。Minicircle
具有最短的质粒骨架序列，但由于不具有复制能力，且受重组效率和纯化手段的限制，生产过程繁琐，产量和纯度较低，难以大规模生产
[2]。2)
基于
RNA
‑
OUT
技术筛选的质粒
。
这类质粒通过编码一段
RNA
‑
OUT
反义链，抑制宿主菌株的负筛选基因
SacB
的表达，从而使转化阳性的克隆能在含蔗糖的培养基上生长，以达到筛选目的
[3]。
这种筛选系统易于放大生产，质粒骨架包含一个
DNA
复制元件和一个
RNA
‑
OUT
元件，序列较
Minicircle
复杂
(450
～
500bp)。

技术实现思路

[0005]在一方面，本文提供了一种前体质粒，其包括：
[0006]1)
复制起始位点；
[0007]2)
筛选标签基因；
[0008]3)
目的基因，或用于插入目的基因的克隆位点；以及
[0009]4)
成对的重组位点，
[0010]其中所述成对的重组位点在重组酶存在下能够使所述前体质粒发生自身重组而形成一分子无筛选标签基因的子质粒和一分子环状双链
DNA
；
[0011]所述子质粒包括所述复制起始位点和所述目的基因，或包括所述复制起始位点和所述克隆位点；所述环状双链
DNA
包括所述筛选标签基因
。
[0012]在一些实施方案中，所述成对的重组位点的序列是同向的
。
[0013]在一些实施方案中，其中所述复制起始位点与所述目的基因或所述克隆位点紧邻，所述成对的重组位点分别紧邻所述复制起始位点和所述目的基因的上游和下游，或所述成对的重组位点分别紧邻所述复制起始位点和所述克隆位点的上游和下游
。
在一些优选实施方案中，所述复制起始位点与所述目的基因或所述克隆位点紧邻，所述成对的重组位点分别位于所述复制起始位点和所述目的基因的两端，或所述成对重组位点分别位于所述复制起始位点和所述克隆位点的两端
。
在另一些优选实施方案中，所述复制起始位点位于所述目的基因或所述克隆位点的一端，所述成对的重组位点分别位于所述复制起始位点和所述目的基因的两端，或所述成对重组位点分别位于所述复制起始位点和所述克隆位点的两端
。
[0014]在一些实施方案中，所述成对的重组位点为同向
loxP
序列
、
同向
FRT
序列或同向
attB/attP
序列
。
[0015]在一些实施方案中，所述成对的重组位点为同向
lox71
序列和
lox66
序列
。
在另一些实施方案中，所述成对的重组位点为同向的
attB
序列和
attP
序列
。
[0016]在一些实施方案中，所述前体质粒可能包括一对或多对成对的重组位点
。
在一个实施方案中，所述前体质粒包含一对成对的重组位点
。
在另一个实施方案中，所述前体质粒包含至少2对成对的重组位点
。
[0017]在一些实施方案中，所述复制起始位点可源自细菌或噬菌体的复制起始位点
。
在一些具体实施方案中，所述复制起始位点为细菌的复制起始位点
。
在一些优选实施方案中，所述复制起始位点选自
pUC
复制起始位点
、pMB1
及其衍生物复制起始位点
、ColE1
复制起始位点和
R6K
γ
复制起始位点
。
在一些实施方案中，所述复制起始位点包含选自以下的序列：如
SEQ ID NO:43
‑
46
所示核苷酸序列，和与
SEQ ID NO:43
‑
46
所示核苷酸序列有至少
80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％或
99
％一致性且能发挥复制起始功能的核苷酸序列
。
在另一些实施方案中，所述复制起始位点包含与
SEQ ID NO:43、44、45
或
46
所示核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
前体质粒，包括：
1)
复制起始位点；
2)
筛选标签基因；
3)
目的基因，或用于插入目的基因的克隆位点；以及
4)
成对的重组位点，其中所述成对的重组位点在重组酶存在下能够使所述前体质粒发生自身重组而形成一分子无筛选标签基因的子质粒和一分子环状双链
DNA
；所述子质粒包括所述复制起始位点和所述目的基因，或包括所述复制起始位点和所述克隆位点；所述环状双链
DNA
包括所述筛选标签基因
。2.
如权利要求1所述的前体质粒，其中所述成对的重组位点的序列是同向的
。3.
如权利要求1或2所述的前体质粒，其中所述复制起始位点与所述目的基因或所述克隆位点紧邻，所述成对的重组位点分别紧邻所述复制起始位点和所述目的基因的上游和下游，或所述成对的重组位点分别紧邻所述复制起始位点和所述克隆位点的上游和下游
。4.
如权利要求1‑3中任一项所述的前体质粒，其中所述成对的重组位点选自同向
loxP
序列
、
同向
FRT
序列和同向
attB/attP
序列
。5.
如权利要求4所述的前体质粒，其中所述成对的重组位点为同向
lox71
序列和
lox66
序列
。6.
如权利要求1‑5中任一项所述的前体质粒，其中所述复制起始位点选自
pUC
复制起始位点
、pMB1
及其衍生物复制起始位点
、ColE1
复制起始位点和
R6K
γ
复制起始位点
。7.
如权利要求6所述的前体质粒，所述复制起始位点包含选自以下的序列：如
SEQ ID NO:43
‑
46
所示核苷酸序列，和与
SEQ ID NO:43
‑
46
所示核苷酸序列有至少
80
％一致性且能发挥复制起始功能的核苷酸序列
。8.
如权利要求1‑7中任一项所述的前体质粒，进一步包括一个或多个选自以下的序列：
rop
基因序列
、
内切酶的编码序列和质粒复制辅助蛋白的编码序列
。9.
如权利要求1‑8中任一项所述的前体质粒，所述筛选标签基因为抗生素抗性基因
。10.
如权利要求1‑9中任一项所述的前体质粒，进一步包含其它质粒骨架序列
。11.
如权利要求1‑
10
中任一项所述的前体质粒，进一步包含所述重组酶的编码基因
。12.
如权利要求
11
所述的前体质粒，其中所述前体质粒能在适宜条件下表达所述重组酶
。13.
如权利要求8‑
11
中任一项所述的前体质粒，其中所述环状双链
DNA
包含一个或多个选自以下的序列：
rop
基因序列
、
其他质粒骨架序列和重组酶的编码基因
。14.
如权利要求1‑
13
中任一项所述的前体质粒，其中所述前体质粒包含
SEQ ID NO
：
8、34、39
‑
42
或
47
所示的核苷酸序列，或者与
SEQ ID NO
：
8、34、39
‑
42
或
47
所示的核苷酸序列有至少
80
％序列一致性的核苷酸序列
。15.
权利要求1‑
14
中任一项所述的前体质粒在制备无筛选标签基因的子质粒中的应用
。16.
制备无筛选标签基因的子质粒的方法，包括：
1)
将权利要求1‑
14
中任一项所述的前体质粒引入能够表达或能够帮助表达所述重组
酶的宿主细胞，并筛选出表达所述筛选标签基因的宿主细胞；
2)
培养步骤
1)
筛选出的宿主细胞，允许所述重组酶在宿主细胞中表达，培养所述宿主细胞并筛选出不表达所述筛选标签基因的宿主细胞；以及
3)
培养步骤
2)
筛选出的宿主细胞并抽提质粒，得到所述子质粒
。17.
如权利要求
16
所述的方法，其中所述成对的重组位点为同向
loxP
序列，所述重组酶为
Cre
重组酶；所述成对的重组位点为同向
FRT
序列，所述重组酶为
Flp
重组酶；或所述成对的重组位点为同向
attB/attP
序列，所述重组酶为
PhiC31
重组酶
。18.
如权利要求
16
或
17
所述的方法，其中所述成对的重组位点为同向
lox71
序列和
lox66
序列，所述重组酶为
Cre
重组酶
。19.
如权利要求
16
‑
18
中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞在其基因组中包括所述重组酶的编码基因，或者所述宿主细胞包括含有所述重组酶的编码基因的表达载体
。20.
如权利要求
16
‑
18
中任一项所述的方法，其中所述前体质粒包含所述重组酶的编码基因，所述前体质粒能在宿主细胞中表达所述重组酶
。21.
如权利要求
16
‑
20
中任一项所述的方法，其中所述重组酶在所述宿主细胞中为诱导型表达
。22.
如权利要求
19
或
21
所述的方法，其中所述表...

【专利技术属性】
技术研发人员：周帆，李一凡，张璐，李竑，
申请(专利权)人：南京金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：