重组载体及其构建方法和应用技术

本申请涉及一种重组载体及其构建方法和应用。该重组载体的构建方法包括如下步骤：构建带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒；向带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段，sgRNA片段用于敲除vGAT，得到重组载体。上述重组载体的构建方法将CRISPR基因编辑技术和化学遗传激活技术结合，得到重组载体能够用于敲除GABA能神经元的vGAT，并通过能化学遗传学激活敲除vGAT的GABA能神经元，达到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的。到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的。到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的。

【技术实现步骤摘要】
重组载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]目前，主要采用光遗传学对特定的细胞进行激活，具有以下局限性：
①
有创性。光遗传学需要埋置光纤陶瓷插芯，是一个有创性手术。
②
活动范围的局限性。若采用有线光遗传激活，需要将光纤与陶瓷插芯链接，这会限制小鼠的活动范围；若采用无线光遗传激活，需要用线圈布置一个磁场，为了保证磁场的强度，小鼠能活动的范围也是有限的。
③
光热效应对细胞的损伤。光遗传学刺激通常采用蓝光，蓝光的光热效应较强，长时间或者多次激活，可能对光纤尖端的神经元造成损伤。
④
适用场景的局限性。正由于前面
②
和
③
提到的活动范围的局限性和光热效应对细胞的损伤，该技术适用的场景有限，需要长时间或者在复杂环境中对小鼠的特定神经元进行操纵时，该技术不再适用。

技术实现思路

[0003]基于此，有必提供一种重组载体及其构建方法和应用。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：构建带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒，所述化学遗传学激活元件用于激活神经元；及向所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段，所述sgRNA片段用于敲除vGAT，得到所述重组载体。2.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，构建所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒的步骤包括：采用质粒重组技术将原始sgRNA骨架质粒与化学遗传学质粒进行质粒重组，所述化学遗传学质粒带有所述化学遗传学激活元件。3.根据权利要求2所述的重组载体的构建方法，其特征在于，构建所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒的步骤包括：将所述原始sgRNA骨架质粒进行酶切，得到含有sgRNA骨架的片段；将所述化学遗传学质粒进行酶切，得到含有所述化学遗传学激活元件的片段；及将所述含有sgRNA骨架的片段和所述含有所述化学遗传学激活元件的片段连接，得到所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒。4.根据权利要求2所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述原始sgRNA骨架质粒包括AAV
‑
U6
‑
sgRNA(backbone)
‑
pCBh
‑
DIO
‑
ChR2
‑
mCherry质粒；所述化学遗传学质粒包括pAAV
‑
hSyn
‑
DIO
‑
hM3D(Gq)
‑
mCherry质粒；所述将原始sgRNA骨架质粒与化学遗传学质粒进行质粒重组的步骤包括：将AAV
‑
U6
‑
sgRNA(backbone)
‑
pCBh
‑
DIO
‑
ChR2
‑
mCherry质粒进行酶切，得到包含AAV
‑
U6
‑
sgRNA(backbone)的片段；将pAAV
‑
hSyn
‑
DIO
‑
hM3D(Gq)
‑
mCherry质粒进行酶切，得到包含DIO
...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱英杰，陈子君，胡靖怡，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：