重组载体及其构建方法和应用技术

本申请涉及一种重组载体及其构建方法和应用。该重组载体的构建方法包括如下步骤：构建带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒；向带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段，sgRNA片段用于敲除vGAT，得到重组载体。上述重组载体的构建方法将CRISPR基因编辑技术和化学遗传激活技术结合，得到重组载体能够用于敲除GABA能神经元的vGAT，并通过能化学遗传学激活敲除vGAT的GABA能神经元，达到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的。到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的。到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的。

【技术实现步骤摘要】
重组载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]目前，主要采用光遗传学对特定的细胞进行激活，具有以下局限性：
①
有创性。光遗传学需要埋置光纤陶瓷插芯，是一个有创性手术。
②
活动范围的局限性。若采用有线光遗传激活，需要将光纤与陶瓷插芯链接，这会限制小鼠的活动范围；若采用无线光遗传激活，需要用线圈布置一个磁场，为了保证磁场的强度，小鼠能活动的范围也是有限的。
③
光热效应对细胞的损伤。光遗传学刺激通常采用蓝光，蓝光的光热效应较强，长时间或者多次激活，可能对光纤尖端的神经元造成损伤。
④
适用场景的局限性。正由于前面
②
和
③
提到的活动范围的局限性和光热效应对细胞的损伤，该技术适用的场景有限，需要长时间或者在复杂环境中对小鼠的特定神经元进行操纵时，该技术不再适用。

技术实现思路

[0003]基于此，有必提供一种重组载体及其构建方法和应用。
[0004]一种重组载体的构建方法，包括如下步骤：
[0005]构建带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒；及
[0006]向所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段，所述sgRNA片段用于敲除vGAT，得到所述重组载体。
[0007]上述重组载体的构建方法将CRISPR基因编辑技术和化学遗传激活技术结合，得到重组载体能够用于敲除GABA能神经元的vGAT，阻断GABA释放，并通过能化学遗传学激活敲除vGAT的GABA能神经元，便于对特定神经元进行长时间激活，达到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的，化学遗传学激活技术是仅通过注射或口服相应的激活药物，无需进行有创手术，具有无创性，提高了动物的适应性，且不再需要通过光纤连接LED给予光刺激，减少了实验过程中的实验装置使用，提高了便利性，也不再需要与光纤连接或者在特定范围的磁场中运动，小鼠的活动范围更加广泛；避免了光热效应带来的细胞损伤，可以长时间对特定神经元进行激活处理，适用范围更广泛。
[0008]在其中一个实施例中，构建所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒的步骤包括：
[0009]采用质粒重组技术将原始sgRNA骨架质粒与化学遗传学质粒进行质粒重组，所述化学遗传学质粒带有所述化学遗传学激活元件。
[0010]在其中一个实施例中，构建所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒的步骤包括：
[0011]将所述原始sgRNA骨架质粒进行酶切，得到含有sgRNA骨架的片段；
[0012]将所述化学遗传学质粒进行酶切，得到含有所述化学遗传学激活元件的片段；及
[0013]将所述含有sgRNA骨架的片段和所述含有所述化学遗传学激活元件的片段连接，
得到所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒。
[0014]在其中一个实施例中，所述原始sgRNA骨架质粒包括AAV
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U6
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sgRNA(backbone)
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pCBh
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DIO
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ChR2
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mCherry质粒；所述化学遗传学质粒包括pAAV
‑
hSyn
‑
DIO
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hM3D(Gq)
‑
mCherry质粒；
[0015]所述将原始sgRNA骨架质粒与化学遗传学质粒进行质粒重组的步骤包括：
[0016]将AAV
‑
U6
‑
sgRNA(backbone)
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pCBh
‑
DIO
‑
ChR2
‑
mCherry质粒进行酶切，得到包含AAV
‑
U6
‑
sgRNA(backbone)的片段；
[0017]将pAAV
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hSyn
‑
DIO
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hM3D(Gq)
‑
mCherry质粒进行酶切，得到包含DIO
‑
hM3D(Gq)
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mCherry的片段；及
[0018]将包含AAV
‑
U6
‑
sgRNA(backbone)的片段和包含DIO
‑
hM3D(Gq)
‑
mCherry的片段连接。
[0019]在其中一个实施例中，所述向所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段的步骤包括：采用质粒重组技术向所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入所述sgRNA片段。
[0020]在其中一个实施例中，所述重组载体为病毒载体，所述向所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段的步骤之后，还包括如下步骤：将插入有所述sgRNA片段的重组质粒包装成病毒。
[0021]在其中一个实施例中，所述sgRNA片段的序列如SEQ ID No.1所示。
[0022]一种重组载体，由上述重组载体的构建方法构建得到。
[0023]一种重组载体，包括：带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒，所述化学遗传学激活元件用于激活神经元，所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中还插入sgRNA片段，所述sgRNA片段用于敲除vGAT。
[0024]在其中一个实施例中，所述化学遗传学激活元件为化学遗传学兴奋性受体。
[0025]在其中一个实施例中，所述sgRNA片段的序列如SEQ ID No.1所示。
[0026]在其中一个实施例中，所述重组载体为病毒载体。
[0027]上述重组载体在制备试剂中的应用，所述试剂用于敲除GABA能神经元的vGAT。
[0028]上述重组载体在制备试剂中的应用，所述试剂用于激活GABA能神经元；
[0029]上述重组载体在制备试剂中的应用，所述试剂用于敲除GABA能神经元的vGAT，并且激活所述GABA能神经元。
[0030]在其中一个实施例中，所述试剂还包括激活剂，所述激活剂用于激活所述化学遗传学激活元件。
[0031]一种激活GABA能神经元的方法，包括如下步骤：
[0032]将上述重组载体包装成病毒后注入动物模型的脑区中表达，然后向所述动物模型注入激活剂，所述动物模型能够表达CRISPR核酸酶，所述激活剂用于激活所述化学遗传学激活元件。
附图说明
[0033]图1为AAV
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U6
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sgRNA(backbone)
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pCBh
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DIO
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ChR2
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mCherry质粒图谱；
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：构建带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒，所述化学遗传学激活元件用于激活神经元；及向所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段，所述sgRNA片段用于敲除vGAT，得到所述重组载体。2.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，构建所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒的步骤包括：采用质粒重组技术将原始sgRNA骨架质粒与化学遗传学质粒进行质粒重组，所述化学遗传学质粒带有所述化学遗传学激活元件。3.根据权利要求2所述的重组载体的构建方法，其特征在于，构建所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒的步骤包括：将所述原始sgRNA骨架质粒进行酶切，得到含有sgRNA骨架的片段；将所述化学遗传学质粒进行酶切，得到含有所述化学遗传学激活元件的片段；及将所述含有sgRNA骨架的片段和所述含有所述化学遗传学激活元件的片段连接，得到所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒。4.根据权利要求2所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述原始sgRNA骨架质粒包括AAV
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U6
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sgRNA(backbone)
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pCBh
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DIO
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ChR2
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mCherry质粒；所述化学遗传学质粒包括pAAV
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hSyn
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DIO
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hM3D(Gq)
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mCherry质粒；所述将原始sgRNA骨架质粒与化学遗传学质粒进行质粒重组的步骤包括：将AAV
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U6
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sgRNA(backbone)
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pCBh
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DIO
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ChR2
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mCherry质粒进行酶切，得到包含AAV
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U6
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sgRNA(backbone)的片段；将pAAV
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hSyn
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DIO
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hM3D(Gq)
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mCherry质粒进行酶切，得到包含DIO
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【专利技术属性】
技术研发人员：朱英杰，陈子君，胡靖怡，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：