用于建立和维持早期胚胎样细胞的培养基和方法技术

提供了用于建立和维持哺乳动物早期胚胎样细胞的培养基和方法

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于建立和维持早期胚胎样细胞的培养基和方法


[0001]本专利技术涉及用于建立和维持哺乳动物早期胚胎样细胞的培养基和方法
。

技术介绍

[0002]哺乳动物胚胎发生是导致胚胎发育的细胞分裂和分化的复杂过程
。
精子与卵母细胞的成功受精会触发胚胎发生的开始
。
这个被严格控制的过程从一个受精卵中产生了数十亿个具有不同功能和形态的细胞
。
所有有性繁殖生物体的巨大的细胞复杂性都始于胚胎发生
。
一开始，单个受精卵会分裂形成2个细胞
。
然后这2个细胞会继续分裂形成4细胞
、8
细胞和
16
细胞
。
在进一步扩增后，胚胎变成由两个区域组成的囊胚
(blastocyst)
，这两个区域分别称为内细胞团
(ICM)
和滋养外胚层
(TE)
，直到这个阶段，胚胎发育被称为植入前
(preimplantation
，在子宫壁
)
阶段
。
在植入
(post
‑
implantation)
后的发育阶段，
ICM
细胞将产生羊膜和所有胎儿组织，而
TE
细胞将产生胎盘
。
所有这些发育阶段都已在小鼠中得到了很好的表征，因为我们可以容易地在无伦理问题的情况下从小鼠胚胎中获取这些细胞
。Evans
和
Kaufman
的开创性工作表明，可以从小鼠囊胚的
ICM
中提取细胞，然后在适当的培养条件下在体外无限期地培养这些细胞
(Evans and Kaufman,1981)。
这些细胞被称为胚胎干细胞
(ESC)
，是小鼠囊胚的
ICM
内的细胞的代表
。
小鼠
ESC
是多能的，但不是全能的，这意味着它们只能分化成胚胎的全部三个胚层
(
外胚层
、
中胚层和内胚层
)
，因此可以产生对应于所有胎儿组织的细胞
。
相反，全能性是细胞形成包括胚胎细胞和胚胎外细胞的整个生物体的能力，而不仅仅是多能细胞情况下产生胎儿组织
。
在小鼠早期胚胎中，早于4细胞阶段的细胞是全能性的，而在人中，全能性至少持续到8细胞
(8C)
阶段
(Hu,2019)。
在
Evans
和
Kaufman
的发现的
17
年后，
Thomson
及其同事能够从人
ICM
产生人
ESC(Thomson et al.,1998)。
[0003]由于人
PSC
在疾病建模和再生医学方面的巨大潜力，因此进行了大量研究以寻找这些细胞的替代来源，而无需破坏人胚胎
。2006
年，
Takahashi
和
Yamanaka
发现了一种从已经分化的细胞产生诱导
PSC(induced PSC,iPSC)
的方法，而无需考虑伦理问题
(Takahashi and Yamanaka,2006)。ESC
和
iPSC
非常相似，在本文统称为
PSC。
[0004]尽管小鼠
ESC
和人
ESC
均来源于植入前囊胚的
ICM
，但它们表现出不同的特征
。
在传统条件下培养的人
PSC
显示出多能性的始发态
(primed)
状态，类似于源自植入后外胚层的小鼠外胚层干细胞
(EpiSC)(Brons et al.,2007
；
Tesar et al.,2007)。
始发态人
PSC
显示扁平集落形态，作为单细胞传代后存活率低，需要成纤维细胞生长因子
2(FGF2)
和转化生长因子
‑
β
1(TGF
β
1)/ACTIVIN A/NODAL
信号转导
(signaling)
，并且无法促进人
‑
小鼠种间嵌合体形成
。
相比之下，小鼠
ESC
处于更接近植入前
ICM
的原始态状态，其特征是圆顶形集落
、
单细胞克隆的形成增加
、
依赖于
Janus
激酶
/
信号转导及转录激活因子
3(JAK/STAT3)
的信号转导
、
植入前
ICM
样转录谱和嵌合的能力
(Nichols and Smith,2011
；
Ying et al.,2008)。
此外，小鼠
ESC
比
EpiSC
具有更大的分化潜能
(Honda et al.,2013)。
此外，近年来有报道称，小鼠
ESC
培养物中的一小部分
(
约
0.5
％
)2
细胞胚胎样细胞
(2CLC)
显示出类似于2细胞
(2C)
阶段小鼠胚胎的转录谱
(Macfarlan et al.,2012)。
这非常重要，因为
2C
细胞是全能
complexe
，
PRC)
和
/
或
EZH2
抑制剂
。
[0011]在一个或多个实施方案中，
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂是端锚聚合酶抑制剂
。
[0012]在一个或多个实施方案中，化学成分限定的培养基进一步补充有一种或多种选自由
L
‑
抗坏血酸或其衍生物
、JAK/STAT3
信号转导激活剂和丝裂原活化蛋白激酶
/
细胞外信号调节激酶
(mitogen
‑
activated protein kinase/extracellular signal
‑
regulated kinase
，
MAPK/ERK)
信号转导抑制剂组成的组的组分；任选地，培养基进一步补充有一种或多种选自由
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂
、Rho
相关蛋白激酶
(Rho
‑
associated protein kinase
，
ROCK)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于培养
PSC
的化学成分限定的培养基，包含用于培养干细胞的基础培养基，补充有
SAH/PRC/EZH2
抑制剂
、HDAC
抑制剂和
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂
。2.
根据权利要求1所述的化学成分限定的培养基，其中所述
SAH/PRC/EZH2
为
SAH
抑制剂，和
/
或所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂为端锚聚合酶抑制剂
。3.
根据权利要求1和2中任一项所述的化学成分限定的培养基，其中所述培养基进一步补充有一种或多种选自由
L
‑
抗坏血酸或其衍生物
、JAK/STAT3
信号转导激活剂
、MAPK/ERK
信号转导抑制剂组成的组的组分；任选地，所述培养基进一步补充有一种或多种选自由
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂
、ROCK
抑制剂和细胞外基质组成的组的组分
。4.
根据权利要求1和2中任一项所述的化学成分限定的培养基，其中：所述
SAH/PRC/EZH2
抑制剂或所述
SAH
抑制剂选自由
DZNep
和
CPI
‑
1205
组成的组；优选地，所述培养基中
DZNep
的终浓度为5至
80nM
，优选5至
50nM
；优选地，所述培养基中
CPI
‑
1205
的终浓度为
0.5
至
5mM
，优选1至
3mM
；和
/
或所述
HDAC
抑制剂选自由
TSA、VPA
和
NaB
组成的组；优选地，所述培养基中
TSA
的终浓度为3至
30nM
，优选3至
25nM
；优选地，所述培养基中
VPA
的终浓度为
0.25
至
2mM
，优选
0.5
至
1.5mM
；优选地，所述培养基中
NaB
的终浓度为
0.25
至
2mM
，优选
0.5
至
1.5mM
；和
/
或所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂或所述端锚聚合酶抑制剂选自由
IWR1
和
XAV939
组成的组；优选地，所述培养基中所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂的终浓度为2至8μ
M。5.
根据权利要求3所述的化学成分限定的培养基，其中：所述培养基中
L
‑
抗坏血酸的终浓度为
40
至
70
μ
g/ml
；和
/
或所述培养基中所述
JAK/STAT3
信号转导激活剂的终浓度为
10
至
50ng/mL
；优选地，所述
JAK/STAT3
信号转导激活剂为
LIF
；和
/
或所述培养基中所述
MAPK/ERK
信号转导抑制剂的终浓度为
0.5
μ
M
至3μ
M
；优选地，所述
MAPK/ERK
信号转导抑制剂为
PD0325901
；和
/
或所述
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂的终浓度为
10
至
25ng/ml
；优选地，所述
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂选自由
ACTIVIN A
和
NODAL
组成的组；和
/
或所述培养基中所述
ROCK
抑制剂的终浓度为
0.5
至2μ
M
；优选地，所述
ROCK
抑制剂选自由
Y27632、thiazovivin
和羟基法舒地尔组成的组；和
/
或所述培养基中所述细胞外基质的量为
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
；优选地，所述细胞外基质选自由
Matrigel
TM
、Geltrex
TM
和
ECM
TM
组成的组
。6.
根据权利要求1所述的化学成分限定的培养基，其中所述培养基包含：
(A)
终浓度为5至
15nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
2mM
的
CPI
‑
1205
；终浓度为3至
30nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
2mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
2mM
的
NaB
，优选地终浓度为3至
10nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
1mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
1mM
的
NaB
；和终浓度为2至8μ
M、
优选3至6μ
M
的
IWR1
或
XAV939
；或者终浓度为5至
80nM、
优选5至
50nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
5mM、
优选
0.5
至
3mM
的
CPI
‑
1205
；终浓度为3至
10nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
0.5mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
0.5mM
的
NaB
；和终浓度为2至8μ
M、
优选3至6μ
M
的
IWR1
或
XAV939
；
(B)
终浓度为
40
至
70
μ
g/ml
的
L
‑
抗坏血酸；
(C)
终浓度为
10
至
30ng/mL
的
LIF
；
(D)
终浓度为
0.5
至
1.5
μ
M
的
PD0325901
；
A
或
NODAL
，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(4)1
μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(5)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，或1μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，或
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质
。10.
根据权利要求1至9中任一项所述的化学成分限定的培养基，其中所述基础培养基选自由以下组成的组：
Dulbecco
改良的
eagle
培养基
(DMEM)、
最小必需培养基
(MEM)、
基础培养基
Eagle(BME)、RPMI1640、F10、F12、
α
最小必需培养基
(
α
MEM)、
格拉斯哥最小必需培养基
(GMEM)、Iscove
改良的
Dulbecco
培养基
、Neurobasal
培养基
、DMEM/F12
和高级
DMEM/F12
及其组合；优选地，所述基础培养基为高级
DMEM/F12
和
Neurobasal
培养基的
1:1(v/v)
比例的混合物
。11.
根据权利要求1至9中任一项所述的化学成分限定的培养基，其中所述培养基进一步补充有一种或多种选自由以下组成的组的组分：血清替代物
、
替代碳源
、
非必需氨基酸
、L
‑
谷氨酰胺或其替代物和抗生素
。12.
根据权利要求
11
所述的化学成分限定的培养基，其中：所述血清替代物选自由以下组成的组：
KOSR、N2
和
B27
及其组合；优选地，所述血清替代物为
N2
和
B27
的
1:1(v/v)
比例的混合物；所述替代碳源为丙酮酸盐，例如丙酮酸钠；所述
L
‑
谷氨酰胺或其替代物为
Glutamax
TM
补充剂，其包含
0.85
％
NaCl
中的
L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺二肽；和
/
或所述抗生素选自由以下组成的组：青霉素
、
链霉素
、
或青霉素和链霉素的混合物
。13.
一种用于将灵长类
PSC
转化为
ICLC
和
/
或
8CLC
或用于将
ICLC
转化为
8CLC
的方法，包括在
SAH/PRC/EZH2
抑制剂
、HDAC
抑制剂和
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂的存在下培养所述灵长类
PSC
或
ICLC
；优选地，所述
SAH/PRC/EZH2
抑制剂为
SAH
抑制剂，并且所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂为端锚聚合酶抑制剂
。14.
根据权利要求
13
所述的方法，其中所述方法包括在
SAH/PRC/EZH2
抑制剂
、HDAC
抑制剂和
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂和一种或多种选自由
L
‑
抗坏血酸
、JAK/STAT3
信号转导激活剂
、MAPK/ERK
信号转导抑制剂组成的组的组分的存在下
、
并且任选地在一种或多种选自由
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂
、ROCK
抑制剂和细胞外基质组成的组的组分的存在下，培养所述灵长类
PSC
或
ICLC。15.
根据权利要求
13
或
14
所述的方法，其中：所述
SAH/PRC/EZH2
抑制剂或所述
SAH
抑制剂选自由
DZNep
和
CPI
‑
1205
组成的组；所述
HDAC
抑制剂选自由
TSA、VPA
和
NaB
组成的组；所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂或所述端锚聚合酶抑制剂选自由
IWR1
和
XAV939
组成的组；优选地，在终浓度为5至
80nM、
优选5至
50nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
5mM、
优选
1.5
至
3mM
的
CPI
‑
1205
的存在下，并且在终浓度为3至
30nM、
优选3至
25nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
2mM、
优选
0.5
至
1.5mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
2mM、
优选
0.5
至
1.5mM
的
NaB
的存在下，并且在终浓度为2至8μ
M
的端锚聚合酶抑制剂的存在下，培养所述灵长类
PSC
或
ICLC。16.
根据权利要求
14
所述的方法，其中：
L
‑
抗坏血酸以
40
至
70
μ
g/ml
的终浓度存在；和
/
或
所述
JAK/STAT3
信号转导激活剂的终浓度为
10
至
50ng/mL
；优选地，所述
JAK/STAT3
信号转导激活剂为
LIF
；和
/
或所述
MAPK/ERK
信号转导抑制剂的终浓度为
0.5
至3μ
M
；优选地，所述
MAPK/ERK
信号转导抑制剂为
PD0325901
；和
/
或所述
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂的终浓度为
10
至
25ng/ml
；优选地，所述
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂选自由
ACTIVIN A
和
NODAL
组成的组；和
/
或所述
ROCK
抑制剂的终浓度为
0.5
至2μ
M
；优选地，所述
ROCK
抑制剂选自由
Y27632、thiazovivin
和羟基法舒地尔组成的组；和
/
或所述细胞外基质以
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量存在；优选地，所述细胞外基质选自由
Matrigel
TM
、Geltrex
TM
和
ECM
TM
组成的组
。17.
一种用于将灵长类
PSC
转化为
ICLC
的方法，包括在如权利要求6或7所述的培养基中培养所述灵长类
PSC
，其中所述培养基的基础培养基选自由以下组成的组：
Dulbecco
改良的
eagle
培养基
(DMEM)、
最小必需培养基
(MEM)、
基础培养基
Eagle(BME)、RPMI1640、F10、F12、
α
最小必需培养基
(
α
MEM)、
格拉斯哥最小必需培养基
(GMEM)、Iscove
改良的
Dulbecco
培养基
、Neurobasal
培养基和
DMEM/F12
及其组合；优选地，所述基础培养基为高级
DMEM/F12
和
Neurobasal
培养基的
1:1(v/v)
比例的混合物
。18.
一种用于将灵长类
PSC
或
ICLC
转化为
8CLC
的方法，包括在如权利要求8或9所述的培养基中培养所述灵长类
PSC
或
ICLC
，其中所述培养基的基础培养基选自由以下组成的组：
Dulbecco
改良的
eagle
培养基
(DMEM)、
最小必需培养基
(MEM)、
基础培养基
Eagle(BME)、RPMI1640、F10、F12、
α
最小必需培养基
(
α
MEM)、
格拉斯哥最小必需培养基
(GMEM)、Iscove
改良的
Dulbecco
培养基
、Neurobasal
培养基
、DMEM/F12
和高级
DMEM/F12
及其组合；优选地，所述基础培养基为高级
DMEM/F12
和
Neurobasal
培养基的
1:1(v/v)
比例的混合物
。19.
一种用于将灵长类
PSC
转化为
ICLC
的方法，包括：
(a)
对所述灵长类
PSC
进行基因工程改造，以通过敲低和
/
或敲除细胞中的一个或多个相关基因来降低所述
PSC
的
SAH、PRC
和
/
或
EZH2
的活性；和
(b)
在培养基中培养步骤
(a)
中获得的基因工程改造细胞，所述培养基包含：终浓度为3至
30nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
2mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
2mM
的
NaB
，优选地终浓度为3至
10nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
1mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
1mM
的
NaB
，终浓度为2至8μ
M、
优选3至6μ
M
的
IWR1
或
XAV939
，终浓度为
40
至
70
μ
g/ml
的
L
‑
抗坏血酸，终浓度为
10
至
30ng/mL
的
LIF
，和终浓度为
0.5
至
1.5
μ
M
的
PD0325901
，和任选地终浓度为5至
15nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
2mM
的
CPI
‑
1205
，或者终浓度为3至
10nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
0.5mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
0.5mM
的
NaB
和任选地终浓度为5至
80nM、
优选5至
50nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
5mM
的
CPI
‑
1205
；其中所述培养基进一步补充有：
(1)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；终浓度在
0.5
至2μ
M
范围内的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；和
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；或
(2)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；和终浓度在
0.5
至2μ
M
范围内的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；或
(3)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；和
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；或
(4)
终浓度为
0.5
至2μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；和
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；或
(5)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；或终浓度为
0.5
至2μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；或
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；优选地，所述培养基包含：
5nM TSA
，或
0.5mM VPA
，或
0.5mM NaB
；
50
μ
g/ml L
‑
抗坏血酸；
20ng/mL LIF
；1μ
M PD0325901
；5μ
M IWR1
或5μ
M XAV939
；和任选地
10nM DZNep
或
1mM CPI
‑
1205
；并且其中所述培养基进一步补充有：
(1)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，1μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(2)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，和1μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；
(3)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(4)1
μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(5)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，或1μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，或
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质
。20.
一种用于将灵长类
PSC
或
ICLC
转化为
8CLC
的方法，包括：
(a)
对所述灵长类
PSC
或
ICLC
进行基因工程改造，以通过敲低和
/
或敲除细胞中的一个或多个相关基因来降低所述
PSC
或
ICLC
的
SAH、PRC
和
/
或
EZH2
的活性；
(b)
在培养基中培养步骤
(a)
中获得的基因工程改造细胞，所述培养基包含：终浓度为
10
至
30nM
的
TSA
，或终浓度为
0.5
至
1.5mM
的
VPA
或终浓度为
0.5
至
1.5mM
的
NaB
；各自的终浓度为2至8μ
M、
优选3至6μ
M
的
IWR1
或
XAV939
；终浓度为
40
至
70
μ
g/ml
的
L
‑
抗坏血酸；终浓度为
10
至
30ng/mL
的
LIF
；终浓度为
0.5
至
1.5
μ
M
的
PD0325901
；和任选地终浓度为
40
至
70nM
的
DZNep
或终浓度为2至
4mM
的
CPI
‑
1205
；并且其中所述培养基进一步补充有：
(1)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；终浓度在
0.5
至2μ
M
范围内的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；和
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；或
(2)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；和终浓度为
0.5
至2μ
M
的<...

【专利技术属性】
技术研发人员：米格尔，
申请(专利权)人：深圳华大科技控股集团有限公司，
类型：发明
国别省市：