用于建立和维持早期胚胎样细胞的培养基和方法技术

提供了用于建立和维持哺乳动物早期胚胎样细胞的培养基和方法

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于建立和维持早期胚胎样细胞的培养基和方法


[0001]本专利技术涉及用于建立和维持哺乳动物早期胚胎样细胞的培养基和方法
。

技术介绍

[0002]哺乳动物胚胎发生是导致胚胎发育的细胞分裂和分化的复杂过程
。
精子与卵母细胞的成功受精会触发胚胎发生的开始
。
这个被严格控制的过程从一个受精卵中产生了数十亿个具有不同功能和形态的细胞
。
所有有性繁殖生物体的巨大的细胞复杂性都始于胚胎发生
。
一开始，单个受精卵会分裂形成2个细胞
。
然后这2个细胞会继续分裂形成4细胞
、8
细胞和
16
细胞
。
在进一步扩增后，胚胎变成由两个区域组成的囊胚
(blastocyst)
，这两个区域分别称为内细胞团
(ICM)
和滋养外胚层
(TE)
，直到这个阶段，胚胎发育被称为植入前
(preimplantation
，在子宫壁
)r/>阶段
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于培养
PSC
的化学成分限定的培养基，包含用于培养干细胞的基础培养基，补充有
SAH/PRC/EZH2
抑制剂
、HDAC
抑制剂和
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂
。2.
根据权利要求1所述的化学成分限定的培养基，其中所述
SAH/PRC/EZH2
为
SAH
抑制剂，和
/
或所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂为端锚聚合酶抑制剂
。3.
根据权利要求1和2中任一项所述的化学成分限定的培养基，其中所述培养基进一步补充有一种或多种选自由
L
‑
抗坏血酸或其衍生物
、JAK/STAT3
信号转导激活剂
、MAPK/ERK
信号转导抑制剂组成的组的组分；任选地，所述培养基进一步补充有一种或多种选自由
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂
、ROCK
抑制剂和细胞外基质组成的组的组分
。4.
根据权利要求1和2中任一项所述的化学成分限定的培养基，其中：所述
SAH/PRC/EZH2
抑制剂或所述
SAH
抑制剂选自由
DZNep
和
CPI
‑
1205
组成的组；优选地，所述培养基中
DZNep
的终浓度为5至
80nM
，优选5至
50nM
；优选地，所述培养基中
CPI
‑
1205
的终浓度为
0.5
至
5mM
，优选1至
3mM
；和
/
或所述
HDAC
抑制剂选自由
TSA、VPA
和
NaB
组成的组；优选地，所述培养基中
TSA
的终浓度为3至
30nM
，优选3至
25nM
；优选地，所述培养基中
VPA
的终浓度为
0.25
至
2mM
，优选
0.5
至
1.5mM
；优选地，所述培养基中
NaB
的终浓度为
0.25
至
2mM
，优选
0.5
至
1.5mM
；和
/
或所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂或所述端锚聚合酶抑制剂选自由
IWR1
和
XAV939
组成的组；优选地，所述培养基中所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂的终浓度为2至8μ
M。5.
根据权利要求3所述的化学成分限定的培养基，其中：所述培养基中
L
‑
抗坏血酸的终浓度为
40
至
70
μ
g/ml
；和
/
或所述培养基中所述
JAK/STAT3
信号转导激活剂的终浓度为
10
至
50ng/mL
；优选地，所述
JAK/STAT3
信号转导激活剂为
LIF
；和
/
或所述培养基中所述
MAPK/ERK
信号转导抑制剂的终浓度为
0.5
μ
M
至3μ
M
；优选地，所述
MAPK/ERK
信号转导抑制剂为
PD0325901
；和
/
或所述
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂的终浓度为
10
至
25ng/ml
；优选地，所述
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂选自由
ACTIVIN A
和
NODAL
组成的组；和
/
或所述培养基中所述
ROCK
抑制剂的终浓度为
0.5
至2μ
M
；优选地，所述
ROCK
抑制剂选自由
Y27632、thiazovivin
和羟基法舒地尔组成的组；和
/
或所述培养基中所述细胞外基质的量为
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
；优选地，所述细胞外基质选自由
Matrigel
TM
、Geltrex
TM
和
ECM
TM
组成的组
。6.
根据权利要求1所述的化学成分限定的培养基，其中所述培养基包含：
(A)
终浓度为5至
15nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
2mM
的
CPI
‑
1205
；终浓度为3至
30nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
2mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
2mM
的
NaB
，优选地终浓度为3至
10nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
1mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
1mM
的
NaB
；和终浓度为2至8μ
M、
优选3至6μ
M
的
IWR1
或
XAV939
；或者终浓度为5至
80nM、
优选5至
50nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
5mM、
优选
0.5
至
3mM
的
CPI
‑
1205
；终浓度为3至
10nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
0.5mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
0.5mM
的
NaB
；和终浓度为2至8μ
M、
优选3至6μ
M
的
IWR1
或
XAV939
；
(B)
终浓度为
40
至
70
μ
g/ml
的
L
‑
抗坏血酸；
(C)
终浓度为
10
至
30ng/mL
的
LIF
；
(D)
终浓度为
0.5
至
1.5
μ
M
的
PD0325901
；
A
或
NODAL
，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(4)1
μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(5)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，或1μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，或
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质
。10.
根据权利要求1至9中任一项所述的化学成分限定的培养基，其中所述基础培养基选自由以下组成的组：
Dulbecco
改良的
eagle
培养基
(DMEM)、
最小必需培养基
(MEM)、
基础培养基
Eagle(BME)、RPMI1640、F10、F12、
α
最小必需培养基
(
α
MEM)、
格拉斯哥最小必需培养基
(GMEM)、Iscove
改良的
Dulbecco
培养基
、Neurobasal
培养基
、DMEM/F12
和高级
DMEM/F12
及其组合；优选地，所述基础培养基为高级
DMEM/F12
和
Neurobasal
培养基的
1:1(v/v)
比例的混合物
。11.
根据权利要求1至9中任一项所述的化学成分限定的培养基，其中所述培养基进一步补充有一种或多种选自由以下组成的组的组分：血清替代物
、
替代碳源
、
非必需氨基酸
、L
‑
谷氨酰胺或其替代物和抗生素
。12.
根据权利要求
11
所述的化学成分限定的培养基，其中：所述血清替代物选自由以下组成的组：
KOSR、N2
和
B27
及其组合；优选地，所述血清替代物为
N2
和
B27
的
1:1(v/v)
比例的混合物；所述替代碳源为丙酮酸盐，例如丙酮酸钠；所述
L
‑
谷氨酰胺或其替代物为
Glutamax
TM
补充剂，其包含
0.85
％
NaCl
中的
L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺二肽；和
/
或所述抗生素选自由以下组成的组：青霉素
、
链霉素
、
或青霉素和链霉素的混合物
。13.
一种用于将灵长类
PSC
转化为
ICLC
和
/
或
8CLC
或用于将
ICLC
转化为
8CLC
的方法，包括在
SAH/PRC/EZH2
抑制剂
、HDAC
抑制剂和
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂的存在下培养所述灵长类
PSC
或
ICLC
；优选地，所述
SAH/PRC/EZH2
抑制剂为
SAH
抑制剂，并且所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂为端锚聚合酶抑制剂
。14.
根据权利要求
13
所述的方法，其中所述方法包括在
SAH/PRC/EZH2
抑制剂
、HDAC
抑制剂和
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂和一种或多种选自由
L
‑
抗坏血酸
、JAK/STAT3
信号转导激活剂
、MAPK/ERK
信号转导抑制剂组成的组的组分的存在下
、
并且任选地在一种或多种选自由
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂
、ROCK
抑制剂和细胞外基质组成的组的组分的存在下，培养所述灵长类
PSC
或
ICLC。15.
根据权利要求
13
或
14
所述的方法，其中：所述
SAH/PRC/EZH2
抑制剂或所述
SAH
抑制剂选自由
DZNep
和
CPI
‑
1205
组成的组；所述
HDAC
抑制剂选自由
TSA、VPA
和
NaB
组成的组；所述
WNT/
β
‑
连环蛋白信号转导抑制剂或所述端锚聚合酶抑制剂选自由
IWR1
和
XAV939
组成的组；优选地，在终浓度为5至
80nM、
优选5至
50nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
5mM、
优选
1.5
至
3mM
的
CPI
‑
1205
的存在下，并且在终浓度为3至
30nM、
优选3至
25nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
2mM、
优选
0.5
至
1.5mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
2mM、
优选
0.5
至
1.5mM
的
NaB
的存在下，并且在终浓度为2至8μ
M
的端锚聚合酶抑制剂的存在下，培养所述灵长类
PSC
或
ICLC。16.
根据权利要求
14
所述的方法，其中：
L
‑
抗坏血酸以
40
至
70
μ
g/ml
的终浓度存在；和
/
或
所述
JAK/STAT3
信号转导激活剂的终浓度为
10
至
50ng/mL
；优选地，所述
JAK/STAT3
信号转导激活剂为
LIF
；和
/
或所述
MAPK/ERK
信号转导抑制剂的终浓度为
0.5
至3μ
M
；优选地，所述
MAPK/ERK
信号转导抑制剂为
PD0325901
；和
/
或所述
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂的终浓度为
10
至
25ng/ml
；优选地，所述
ACTIVIN/NODAL
信号转导激活剂选自由
ACTIVIN A
和
NODAL
组成的组；和
/
或所述
ROCK
抑制剂的终浓度为
0.5
至2μ
M
；优选地，所述
ROCK
抑制剂选自由
Y27632、thiazovivin
和羟基法舒地尔组成的组；和
/
或所述细胞外基质以
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量存在；优选地，所述细胞外基质选自由
Matrigel
TM
、Geltrex
TM
和
ECM
TM
组成的组
。17.
一种用于将灵长类
PSC
转化为
ICLC
的方法，包括在如权利要求6或7所述的培养基中培养所述灵长类
PSC
，其中所述培养基的基础培养基选自由以下组成的组：
Dulbecco
改良的
eagle
培养基
(DMEM)、
最小必需培养基
(MEM)、
基础培养基
Eagle(BME)、RPMI1640、F10、F12、
α
最小必需培养基
(
α
MEM)、
格拉斯哥最小必需培养基
(GMEM)、Iscove
改良的
Dulbecco
培养基
、Neurobasal
培养基和
DMEM/F12
及其组合；优选地，所述基础培养基为高级
DMEM/F12
和
Neurobasal
培养基的
1:1(v/v)
比例的混合物
。18.
一种用于将灵长类
PSC
或
ICLC
转化为
8CLC
的方法，包括在如权利要求8或9所述的培养基中培养所述灵长类
PSC
或
ICLC
，其中所述培养基的基础培养基选自由以下组成的组：
Dulbecco
改良的
eagle
培养基
(DMEM)、
最小必需培养基
(MEM)、
基础培养基
Eagle(BME)、RPMI1640、F10、F12、
α
最小必需培养基
(
α
MEM)、
格拉斯哥最小必需培养基
(GMEM)、Iscove
改良的
Dulbecco
培养基
、Neurobasal
培养基
、DMEM/F12
和高级
DMEM/F12
及其组合；优选地，所述基础培养基为高级
DMEM/F12
和
Neurobasal
培养基的
1:1(v/v)
比例的混合物
。19.
一种用于将灵长类
PSC
转化为
ICLC
的方法，包括：
(a)
对所述灵长类
PSC
进行基因工程改造，以通过敲低和
/
或敲除细胞中的一个或多个相关基因来降低所述
PSC
的
SAH、PRC
和
/
或
EZH2
的活性；和
(b)
在培养基中培养步骤
(a)
中获得的基因工程改造细胞，所述培养基包含：终浓度为3至
30nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
2mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
2mM
的
NaB
，优选地终浓度为3至
10nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
1mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
1mM
的
NaB
，终浓度为2至8μ
M、
优选3至6μ
M
的
IWR1
或
XAV939
，终浓度为
40
至
70
μ
g/ml
的
L
‑
抗坏血酸，终浓度为
10
至
30ng/mL
的
LIF
，和终浓度为
0.5
至
1.5
μ
M
的
PD0325901
，和任选地终浓度为5至
15nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
2mM
的
CPI
‑
1205
，或者终浓度为3至
10nM
的
TSA
，或终浓度为
0.25
至
0.5mM
的
VPA
，或终浓度为
0.25
至
0.5mM
的
NaB
和任选地终浓度为5至
80nM、
优选5至
50nM
的
DZNep
或终浓度为
0.5
至
5mM
的
CPI
‑
1205
；其中所述培养基进一步补充有：
(1)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；终浓度在
0.5
至2μ
M
范围内的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；和
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；或
(2)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；和终浓度在
0.5
至2μ
M
范围内的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；或
(3)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；和
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；或
(4)
终浓度为
0.5
至2μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；和
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；或
(5)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；或终浓度为
0.5
至2μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；或
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；优选地，所述培养基包含：
5nM TSA
，或
0.5mM VPA
，或
0.5mM NaB
；
50
μ
g/ml L
‑
抗坏血酸；
20ng/mL LIF
；1μ
M PD0325901
；5μ
M IWR1
或5μ
M XAV939
；和任选地
10nM DZNep
或
1mM CPI
‑
1205
；并且其中所述培养基进一步补充有：
(1)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，1μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(2)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，和1μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；
(3)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(4)1
μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，和
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质；或
(5)20ng/mL
的
ACTIVIN A
或
NODAL
，或1μ
M
的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔，或
0.2
％
(v/v)
的细胞外基质
。20.
一种用于将灵长类
PSC
或
ICLC
转化为
8CLC
的方法，包括：
(a)
对所述灵长类
PSC
或
ICLC
进行基因工程改造，以通过敲低和
/
或敲除细胞中的一个或多个相关基因来降低所述
PSC
或
ICLC
的
SAH、PRC
和
/
或
EZH2
的活性；
(b)
在培养基中培养步骤
(a)
中获得的基因工程改造细胞，所述培养基包含：终浓度为
10
至
30nM
的
TSA
，或终浓度为
0.5
至
1.5mM
的
VPA
或终浓度为
0.5
至
1.5mM
的
NaB
；各自的终浓度为2至8μ
M、
优选3至6μ
M
的
IWR1
或
XAV939
；终浓度为
40
至
70
μ
g/ml
的
L
‑
抗坏血酸；终浓度为
10
至
30ng/mL
的
LIF
；终浓度为
0.5
至
1.5
μ
M
的
PD0325901
；和任选地终浓度为
40
至
70nM
的
DZNep
或终浓度为2至
4mM
的
CPI
‑
1205
；并且其中所述培养基进一步补充有：
(1)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；终浓度在
0.5
至2μ
M
范围内的
Y27632、thiazovivin
或羟基法舒地尔；和
0.1
％至
0.5
％
(v/v)
的量的细胞外基质；或
(2)
终浓度为
10
至
25ng/ml
的
ACTIVIN A
或
NODAL
；和终浓度为
0.5
至2μ
M
的<...

【专利技术属性】
技术研发人员：米格尔，
申请(专利权)人：深圳华大科技控股集团有限公司，
类型：发明
国别省市：