高效的制造技术

记忆样细胞因子增强的

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高效的M
‑
CENK细胞和方法
[0001]本申请要求我们于
2021
年3月3日提交的序列号
63/156,269
和
2021
年6月
30
日提交的序列号
63/217,097
的共同未决的美国临时申请的优先权，其中每个临时申请通过引用以其全文并入本文
。


[0002]本专利技术的领域是基于细胞的治疗剂及其相关方法，特别是因为它们涉及具有改善的细胞毒性和扩增特征的记忆样细胞因子增强的
NK
细胞
(M
‑
CENK)。

技术介绍

[0003]背景描述包括可用于理解本专利技术的信息
。
并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的专利技术相关，也不承认特别地或隐含地引用的任何出版物是现有技术
。
[0004]本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被特别地且单独地指明通过引用并入一样
。
在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义
。
[0005]自然杀伤
(NK)
细胞构成一组先天免疫细胞，其常常表征为经由颗粒溶素和穿孔素的靶标定向释放而表现出抗体依赖性细胞毒性的细胞毒性淋巴细胞
。
大多数
NK
细胞除了具有各种活化性和抑制性受体外还具有特异性的细胞表面标记谱
(
例如，
CD3
‑
、CD56
+
、CD16
+
、CD57
+
、CD8
+
)。
尽管最近
NK
细胞已经成为某些癌症治疗的重要组成部分，但是由于全血中
NK
细胞的比例相对较低，因此生成大量
NK
细胞
(
尤其是自体
NK
细胞
)
一直非常困难
。
[0006]为了获得治疗上有意义数量的
NK
细胞和
NK
样细胞，可以从各种前体细胞生成
NK
细胞
。
例如，各种干细胞因子
(SCF)、FLT3
配体
、
白细胞介素
(IL)
‑
2、IL
‑7和
IL
‑
15
已经在各种体外诱导和扩增脐带血来源的细胞因子诱导的杀伤
(CIK)
细胞的方法中进行了报道
(Anticancer Research[
抗癌研究
]30:3493
‑
3500(2010))。
类似地，
CD34
+
造血细胞可以暴露于
IL
‑
12
和其他药剂，如
US2018/0044636
中所报道的
。
在其他方法中，人成血管细胞顺序暴露于两种不同的细胞因子混合物，如
WO 2011/068896
中所述，并且不同的细胞因子混合物与胚胎后造血干细胞一起使用，如
WO 2012/128622
中所教导的
。
尽管这些方法中的至少一些提供了
NK
细胞的显著
n
倍扩增，但用于这种扩增的方法和试剂既需要时间又需要资源
。
此外，应指出，许多已知的方法还需要在饲养细胞层上培养
NK
细胞，这从技术和监管角度来看常常是有问题的
。
[0007]在更简单的方法中，急性髓系白血病
(AML)
细胞可以暴露于
TpoR
激动剂，从而诱导
AML
细胞形成
NK
细胞
。
然而，这种方法作为治疗性细胞制剂的来源可能是不可行的
。
替代性方法还依赖于在各种白细胞介素
、
干细胞因子和
FLT3
配体存在下培养外周血细胞，如
WO 2011/103882
中公开的
。
在又一种方法中，
US2013/0295671
教导了用抗
CD16
和抗
CD3
抗体以及细胞因子刺激已经存在的
NK
细胞的方法
。
虽然在程序上更简单，但此类方法仍然需要对
细胞进行精细的操作，并且由于所需的特定试剂而大大增加了成本
。
[0008]在进一步已知的方法中，
US10,125,351
描述了使用脐带血或外周血作为细胞来源，对其进行密度梯度分离以分离有核细胞，然后用含有干扰素
、
白细胞介素
、CD3
抗体和人白蛋白的培养基培育这些有核细胞
。
最有利的是，这种方法适于在生物反应器中进行灌注培养，并因此显著降低操作难度
。
不幸的是，
NK
细胞的产量仍相对较低
。
[0009]无论特定的生产方式如何，培育的
NK
细胞通常不会表现出记忆样特征，而记忆样特征对于癌症免疫疗法是尤其希望的
。
在至少一些产生记忆样
NK
细胞的尝试中，将选择的
NK
细胞暴露于
IL
‑
12、IL
‑
15
和
IL
‑
18
，因此所暴露的
NK
细胞表现出记忆样表型并且与
CD94、NKG2A、NKG2C
和
CD69
的表达及
CD57
和
KIR
的缺乏相关
(
参见
Blood[
血液
](2012)
第
120
卷
,
第
24
期；
4751
‑
4760)。
类似地，记忆样
NK
细胞通过以下制备：使用各种刺激细胞因子预活化
NK
细胞，随后使预活化细胞与
PM21
颗粒
、EX21
外泌体或
FC21
饲养细胞接触，如
WO 2018/089476
和
US10,300,089
中所述
。
在生成记忆样
NK
细胞的又一种方法中，将新鲜分离的
NK
细胞暴露于
IL
‑
18/IL
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种生成记忆样细胞因子增强的自然杀伤
(M
‑
CENK)
细胞的方法，该方法包括：获得多个单个核细胞，并使该多个单个核细胞与皮质类固醇和任选地细胞因子或细胞因子类似物接触；在该皮质类固醇和该任选的细胞因子或细胞因子类似物的存在下孵育该多个单个核细胞，以在
NK
细胞中富集这些单个核细胞；以及用
TxM
融合蛋白诱导这些富集的
NK
细胞以生成这些
M
‑
CENK
细胞，其中该
TxM
融合蛋白包含具有
IL
‑
12
活性的蛋白质部分
、
具有
IL
‑
15
活性的蛋白质部分和具有
IL
‑
18
活性的蛋白质部分
。2.
如权利要求1所述的方法，其中在孵育步骤之前，冷冻保存该多个单个核细胞
。3.
如权利要求2所述的方法，其中在含有该皮质类固醇和该任选的细胞因子的培养基中解冻
、
洗涤并重悬这些冷冻保存的单个核细胞
。4.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在
14
至
21
天之间的时间内进行该孵育步骤
。5.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行该孵育步骤直到这些
NK
细胞富集到所有活细胞的至少
65
％
。6.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在1‑
25
μ
g/mL
之间的
TxM
浓度下诱导这些富集的
NK
细胞
。7.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在
12
至
16
小时之间的时间内诱导这些富集的
NK
细胞
。8.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该皮质类固醇是氢化可的松，并且该任选的细胞因子是
N
‑
803。9.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该孵育步骤包括该任选的细胞因子
。10.
如前述权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括收获这些
M
‑
CENK
细胞并将收获的
M
‑
CENK
细胞配制用于输注的步骤
。11.
如权利要求
10
所述的方法，其中这些收获的
M
‑
CENK
细胞在输注前冷冻保存
。12.
一种产生记忆样细...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：免疫生物公司，
类型：发明
国别省市：