用于制造技术

本申请涉及淋巴细胞培养技术领域的一种用于

【技术实现步骤摘要】
用于CIK细胞培养的无血清培养基、培养方法和应用


[0001]本申请涉及淋巴细胞培养
，尤其是涉及一种用于
CIK
细胞培养的无血清培养基
、
培养方法和应用
。

技术介绍

[0002]通常，体外培养的动物细胞的生长均有赖于血清的存在，由于获取的难易程度和数量限制，多使用人
AB
血清和牛源
、
马源等动物血清，而人源和动物源血清均存在潜在的外源病毒污染
(
如
HIV
‑
1、HCV、HBV、HCMV、EBV、HPV、HHV
‑
6/7、
人细小病毒
B19、HTLV1
和牛源病毒等
)
和致病因子感染的风险，此外，由于不同批次血清间的生物活性和因子含量的不一致，导致批次间存在较大差异
。
[0003]无血清培养基，则是在某种基础培养基的基础上添加了成分明确的血清替代物，如蛋白
、
脂类
、
激素和微量元素等物质，替代血清提供给细胞增殖所必需的营养成分，且能够减少血清中不明组分带来的不利因素，稳定细胞培养的条件，缩小批次间差异，也可以简化鉴定各种细胞产物的程序，从源头避免病毒污染造成的危害
。
[0004]CIK(cytokine
‑
induced killer)
细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，由于该种细胞同时表达
CD3+
和
CD56+
两种膜蛋白分子，故又被称为
NK
细胞样
T
淋巴细胞，兼具有
T
淋巴细胞强大的抗瘤活性和
NK
细胞的非
MHC
限制性杀瘤优点
。
因此，应用
CIK
细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案，而
CD3+CD56+
的
CIK
细胞群在正常人外周血和人脐带血中比例较小，仅1％
‑5％左右，因此有必要对
CIK
细胞群进行体外培养
。
[0005]市售的商品化淋巴细胞无血清培养基体外培养的
CIK
细胞阳性率较低，多不稳定，且增殖较慢，仍需要搭配如人
AB
血清或胎牛血清等物质来促进细胞增殖，无法实现工业化的大规模稳定培养，更无法排除潜在的病原体污染风险
。
因此，急需要开发出一款无需额外添加血清的安全性可控
、
增殖速率和阳性率均佳的无血清培养基用于应对市场需求
。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于
CIK
细胞培养的无血清培养基，该培养基不含人源和动物源成分，所有蛋白成分均为人重组来源，无需搭配人
AB
血清或动物源血清使用，且能够稳定培养出高阳性率
(CD3+CD56+)
的
CIK
细胞群，并可以安全用于后续临床治疗等用途
。
[0007]为此，本申请第一方面提供了一种用于
CIK
细胞培养的无血清培养基，所述无血清培养基包括基础培养基，且所述基础培养基中添加有重组人转铁蛋白
、
重组人胰岛素
、
重组人白蛋白
、
乙醇胺
、
脂质混合物
、
微量元素
、
α
‑
环糊精
、
非必需氨基酸
、
碳酸氢钠
、
烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物
。
[0008]本申请中，所述无血清培养基中含有的蛋白均为人重组来源，生物安全性高且培养性能稳定
。
培养基中重组人转铁蛋白
、
重组人胰岛素和重组人白蛋白的添加，能够提供细胞生长代谢所必须的营养物质；其中，重组人转铁蛋白能与三价铁离子可逆性结合，其在铁
离子的转运和代谢中发挥着至关重要的作用，同时也是一种重要的胞外抗氧化剂；重组人胰岛素可以促进糖和氨基酸转运，提高合成代谢降低分解代谢，刺激细胞生长；重组人白蛋白能够维持培养液体系的渗透压和
pH
值，促进脂质
、
金属离子
、
氨基酸和其它因子等重要配体的结合和运输，同时具有抗氧化功能
。
乙醇胺是一种重要的刺激细胞生长的化合物，是脑磷酸的合成前体；脂质混合物中的脂类是细胞膜的重要组成部分，参与信号转导；微量元素是细胞代谢的主要成分，调节各类酶活反应，对于细胞生长代谢和产物合成都有促进作用；非必需氨基酸是细胞主要的氮源，且可作为细胞生长的能源物质和嘌呤
、
嘧啶核苷酸的前体；
α
‑
环糊精能够增溶脂质，且具有优异的包合特性，有利于保护营养物质的稳定性；碳酸氢钠
(NaHCO3)
是一种无毒的天然缓冲液，能够稳定培养液体系
pH
值的变化
。
[0009]更为重要的是，本申请所述无血清培养基中还包括烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物，烟酰胺单核苷酸
(
β
‑
NMN)
是
NAD+
的前体物质，
β
‑
NMN
腺苷酸转移酶将
β
‑
NMN
转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
(NAD+)
，而
NAD+
参与线粒体电子传递等多种氧化还原反应，作为多种酶的底物，参与细胞信号传导
、DNA
损伤修复
、
表观遗传修饰等生物学过程，能够活化淋巴细胞，促进淋巴细胞增殖；虾青素提取物是一种新型抗氧化剂，具有极强的抗氧化能力，能够从细胞表面和磷脂膜内部清除自由基和促炎因子，减少氧化应激反应并保持线粒体完整性，同时除抗氧化功能外，虾青素还具有免疫调节作用，作用于丝裂原诱导淋巴细胞增殖，增加细胞毒性，提高细胞因子
IFN
‑
γ
和
IL
‑2分泌量
。
本申请的专利技术人通过研究发现，在无血清培养基中添加烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物后，能够使
CIK
细胞在培养基中的增殖倍数
、
细胞存活率以及阳性率
(CD3+CD56+)
得到明显提升，获得更佳的
CIK
细胞培养效果
。
[0010]本申请对无血清培养基中的基础培养基的具体种类没有明确限定
。
在一些具体实施方式中，所述基础培养基选自
RPMI1640、DMEM、DMEM/F12
和
IMDM
中的任意一种
。
[0011]本申请中，所述培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于
CIK
细胞培养的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包括基础培养基，且所述基础培养基中添加有重组人转铁蛋白
、
重组人胰岛素
、
重组人白蛋白
、
乙醇胺
、
脂质混合物
、
微量元素
、
α
‑
环糊精
、
非必需氨基酸
、
碳酸氢钠
、
烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物
。2.
根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基中包括重组人转铁蛋白
1~20mg/L、
重组人胰岛素
1~20mg/L、
重组人白蛋白
1~10g/L、
乙醇胺
0.5~5mg/L、
脂质混合物
1~5mL/L、
微量元素
1~10mL/L、
α
‑
环糊精
0.5~1.5g/L、
非必需氨基酸
1~5mL/L、
碳酸氢钠
2~4g/L、
烟酰胺单核苷酸
1~10mg/L
和虾青素提取物
5~20mg/L。3.
根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，所述脂质混合物选自花生四烯酸
、
亚油酸
、
亚麻酸
、
肉豆蔻酸
、
油酸
、
棕榈酸
、
硬脂酸和生育酚乙酸酯中的一种或多种
。4.
根据权利要求3所述的无血清培养基，其特征在于，所述脂质混合物为花生四烯酸
、
亚油酸
、
亚麻酸和油酸的混合物，且所述混合物中花生四烯酸
、
亚油酸
、
亚麻酸和油酸的质量比为（
1~3
）
:1:1:
（
1~3
）
。5.
根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，所述微量元素选自亚硒酸钠
、
柠檬酸铁
、
偏钒铵酸
、
氯化锰
、
硫酸铜和硫酸锌中...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢委翰，黄彬彬，罗秋莹，陈磊辉，
申请(专利权)人：广东瑞程医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：