【技术实现步骤摘要】
一种同位素示踪与宏基因组相结合的解析氮限制生态系统的方法
[0001]本专利技术属于氮循环转化及生物信息学领域，更具体地，涉及一种同位素示踪与宏基因组相结合的解析氮限制生态系统的方法
。
技术介绍
[0002]氮是生物体生长和发展所必需的关键元素之一，在生态系统中扮演着重要的生物地球化学角色
。
然而，当前许多生态系统面临氮限制的问题，即氮供应不足，无法满足生物体对氮的需求
。
据
2020
年
《Nature Geoscience》
的研究指出，全球自然陆地生态系统中有
18
％的区域面临较强的氮限制
。
这些氮限制生态系统广泛分布于河口
、
森林和海洋等自然环境中
。
氮的限制对生态系统的影响不仅仅局限于生物体的生长和代谢，还涉及物质循环
、
能量流动
、
微生物群落结构和物种组成的改变，以及生态系统的稳定性和功能
。
[0003]在氮限制...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
一种同位素示踪与宏基因组相结合的解析氮限制生态系统的方法，具体步骤如下：步骤一
、
选取拟研究的氮限制生态系统进行土壤或者沉积物样品的采集；步骤二
、
采集完的样品进行物理化学指标的测定以及
DNA
的提取；步骤三
、
构建泥浆混合体系，添加
15
N
进行同位素示踪实验，在一个体系内同时测定反硝化
、DNRA
以及
Anammox
过程的速率；步骤四：对提取的
DNA
进行建库，并且使用
Illumina
测序技术进行环境样品的宏基因组测序，通过
metaWRAP
等手段进行宏基因组数据的组装和分箱；步骤五：使用
KEGG
和
NCycDB
数据库进行氮转化相关功能基因丰度的计算，并通过筛选出相关功能基因对应的序列，结合
Kraken2
进行功能基因对应的微生物物种起源的探索；步骤六：通过
Mantel Test
以及
Spearman
相关性分析将微生物学的信息，物理化学指标和氮转化的速率联系起来，得到影响氮转化过程的相关因子；步骤七：将步骤六得到的影响因子，通过宏基因组分箱得到的氮转化相关
MAGs
的功能代谢分析去进一步解释影响的机制，最终解析氮限制生态系统内部的动态过程
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，采用冷冻研磨和十二烷基硫酸钠
SDS
裂解法进行样品
DNA
的初始提取，得到粗
DNA
之后，进一步使用
Power Soil DNA
纯化试剂盒进行
DNA
的纯化，从而得到更高质量的
DNA
；之后通过
NanoDrop
评估
DNA
的质量，使得
260/280
和
260/230
比例分别为
1.8
‑
1.9
和
1.7
以上
,
并使用荧光法测定
DNA
的浓度
。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，将
1.0g
环境样品与
6.0ml
无菌水混合在一个
12.0ml
的顶空进样瓶内
,
然后用
99.99
％的高纯度氦气通气
30
分钟，创造一个无氧的环境；并将该体系在没有任何外源底物的情况下摇床预培养
72
小时，以完全消耗体系中的
NO3‑
和
NO2‑
，同时为了抑制硝化作用，使用进样针向系统中加入
50ul
浓度为
18.0g/L
的烯丙基硫脲；之后，使用进样针向瓶内中添加
100ul
浓度为
10mM
的
Na
15
NO3，将加入完同位素的泥浆混合体系在
25℃
以及
200rpm
的摇床速度下孵育，通过在
0、6、12
和
24
小时时注入
100ul
浓度为
7mol/L
的氯化锌来终止反应；使用
Gasbench
‑
IRMS
在不同的时间点测量
29
N2和
30
N2的产生量，由此得到反硝化和厌氧氨氧化的速率，计算公式如下：其中
R
denitrification
和
R
anammox
分别为反硝化和厌氧氨氧化的速率，单位为
nmol N g
‑1h
‑1；
P
30
和
P
29
分别是通过反硝化和厌氧氨氧化产生的
30
N2和
29
N2的量
。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，测定完反硝化和厌氧氨氧化速率后剩下的泥浆混合液进行重新的
30min
氦气曝气，然后加入
200ul
的次溴酸碘溶液使
DNRA
过程产生的
15
NH
4+
转化为
N2时进行第二次的测定，计算公式如下：其中，
R
DNRA
为
DNRA
过程的速率，
P
29
’
和
P
30
’
是由
DNRA
过程产生的
15
NH
4+
经过氧化剂化学反应后产生的
29
N2和
30
N2的量；同时所述
29
N2和
30
N2的...
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