以制造技术

本发明专利技术提供了一种以

【技术实现步骤摘要】
以BCMA胞外结构域为标记的基因、多肽、重组表达载体、基因工程化细胞及其应用


[0001]本专利技术涉及细胞免疫治疗
，具体地，涉及一种
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA、
编码的
tBCMA
多肽
、
重组表达载体
、
基因工程化细胞及其应用
。

技术介绍

[0002]基因工程化免疫细胞，例如
CAR
‑
T
细胞，在制备和回输后的检测都很重要
。
基因工程化免疫细胞的检测决定着回输正确的剂量
、
监测回输细胞在体内的持续和扩增，与治疗效果的评估和毒副作用的干预密切相关
。
此外，在临床治疗上因为严重毒副作用有必要及时去除输入的免疫细胞时，清除这些细胞的策略也很重要
。
[0003]标记基因能够对基因工程化的免疫细胞进行有效地检测和阳性筛选
。
特别是在基因工程化的免疫细胞上表达一些不易于检测的细胞表面蛋白时，造成这些免疫细胞在制备时的检测和回输后跟踪方面的困难，采用标记基因尤为重要
。
此外，在临床治疗上因为严重毒副作用有必要去除回输的免疫细胞时，例如异体
T
细胞回输造成移植物抗宿主疾病或
CAR
‑
T
细胞的回输产生严重的毒副作用，标记基因表达的蛋白可以作为靶标用于这些回输免疫细胞的清除
。
[0004]目前常用的/>CAR
‑
T
细胞监测方法主要针对由单链抗体组成的
CAR
的胞外抗原识别域进行检测
。
检测方法通常采用
protein L,Goat anti
‑
human/mouse IgG F(ab
’
)2fragment,or Antigen
‑
Fc。
这些检测方法往往因为缺乏特异性和敏感性而不能充分满足基因工程化免疫细胞检测的需要
。
[0005]由于标记基因对基因工程化免疫细胞的重要性，目前已有多种标记基因在科研和临床实验中应用，其中包括多种截断的
I
型跨膜蛋白，例如
CD19、CD34
和
EGFR。CD19
和
CD34
的一个特点使现成的
Miltenyi CliniMACS
筛选系统可用于临床级别的分选
。
人表皮生长因子受体
(EGFR)
是生长因子受体
ErbB
家族的酪氨酸激酶受体，在造血和淋巴系统的细胞上不表达
。
西妥昔单抗
cetuximab(Erbitux)
，是一种靶向
EGFR
的抗体类药物，已被美国
FDA
许可用于治疗转移性结直肠癌，头部和颈部癌症
。
截断的
EGFR(EGFRt)
可以作为基因工程化免疫细胞的标记
。
在
EGFRt
中，其
I、II
胞外域和胞内信号域被删除
,
其
III
胞外域的西妥昔单抗结合位点得到保留
。EGFRt
可以通过基因工程化
T
细胞作为标记用于免疫磁性富集
、
流式和免疫组化检测，以及采用西妥昔单抗进行体内基因工程化
T
细胞的清除
。
虽然以上这些细胞表面蛋白可以作为标志基因，但他们均具有相对较大的分子量，因而可能会增加基因载体的负荷和减少载体的转导效率，以及会影响基因修饰蛋白在
T
细胞上的表达密度
、
与靶标抗原的结合能力和肿瘤杀伤效果
。
[0006]基因工程化免疫细胞的检测，对免疫细胞的制备和回输后的观察都很重要，决定着回输细胞的正确剂量
、
监测回输细胞在体内的持续和扩增，与治疗效果的评估和毒副作用的干预密切相关
。
而现有的检测方法往往因为缺乏特异性和敏感性而不能充分满足基因工程化免疫细胞检测的需要
。
而现有采用标记基因对基因工程化免疫细胞的检测方法也因
为这些标记基因具有较大的分子量，因而可能会增加基因载体的负荷和减少载体的转导效率，以及会影响基因对基因工程化免疫细胞的靶标抗原结合能力和肿瘤杀伤效果
。
此外，在临床治疗上因为严重毒副作用有必要及时去除回输细胞时，清除这些细胞的策略也很重要
。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA、
编码的
tBCMA
多肽
、
重组表达载体
、
基因工程化细胞及其应用
。
主要采用
tBCMA
多肽作为标记，用于基因工程化免疫细胞的检测和清除
。
[0008]本专利技术的目的是通过以下方案实现的：
[0009]本专利技术的第一方面提供一种
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA
，所述基因
tBCMA
为编码
BCMA
胞外结构域全部或部分序列的基因，或者编码与所述全部或部分序列具有至少
85
％相同的序列的基因，所述基因
BCMA
的核苷酸序列为
SEQ ID NO.1
所示，所述基因
tBCMA
的核苷酸全序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0010]本专利技术的第二方面提供一种
BCMA
胞外结构域
tBCMA
多肽，所述
tBCMA
多肽是通过第一方面所述的
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA
编码的多肽，
BCMA
编码的多肽氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，基因
tBCMA
编码的多肽氨基酸全序列如
SEQ ID NO.4
所示
。
[0011]本专利技术的第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第一方面所述的基因
tBCMA
的核苷酸序列
。
[0012]本专利技术的第四方面提供一种基因工程化细胞，所述基因工程化细胞中包括第一方面所述的
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA。
[0013]在另一优选例中，所述基因工程化细胞是通过基因工程修饰的免疫细胞
。
[0014]在另一优选例中，所述免疫细胞包括但不限于
T
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
BCMA
胞外结构域基因
tBCMA
，其特征在于，所述基因
tBCMA
为编码
BCMA
胞外结构域全部或部分序列的基因，或者编码与所述全部或部分序列具有至少
85
％相同的序列的基因，所述基因
tBCMA
的核苷酸全序列如
SEQ ID NO.2
所示
。2.
一种
BCMA
胞外结构域
tBCMA
多肽，其特征在于，所述
tBCMA
多肽是通过权利要求1所述的
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA
编码的多肽，基因
tBCMA
编码的多肽氨基酸全序列如
SEQ ID NO.4
所示
。3.
一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求1所述的基因
tBCMA
的核苷酸序列
。4.
一种基因工程化细胞，其特征在于，所述基因工程化细胞中包括权利要求1所述的
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA。5.
根据权利要求4所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述基因工程化细胞是通过基因工程修饰的免疫细胞
。6.
根据权利要求5所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括
T
细胞
、
γδ
T
细胞
、NK
细胞
、NKT
细胞或巨噬细胞，及诱导多能干细胞分化的
T
细胞
、
γδ
T
细胞
、NK
细胞
、NKT
细胞或巨噬细胞
。7.
根据权利要求6所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
T
细胞为
CAR
‑
T
细胞，所述
CAR
‑
T
细胞包含权利要求1所述的
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA
作为标记基因
。8.
根据权利要求7所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
CAR
‑
T
细胞为抗原结合域靶向以下任一靶标的
CAR
‑
T
细胞，所述靶标包括但不限于
CD1a、CD2、CD4、CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD30、CD32b、CD33、CD34、CD37、CD38、CD44v6、CD56、CD70、CD79b、CD83、CD117、CD123、CD133、CD138、CD155、CD171、CD276、CD319、CD371、Chlorotoxin、FLT3、Folate receptorbeta、GPRC5D、IL1RAP、Lag
‑
3、LewY、Sigelec
‑
6、LILRB4、LMP1、B7H6、NKG2DLs、PD
‑
L1、ROR1、TIM3、CEA、Claudin
‑
6、Claudin
‑
18.2、EGFR、EGFRvIII、EpCam、EphA2、Fibroblast activation protein alpha、GTPase
‑
activating protein、GD2、Glypican
‑
1、GPC2、GPC3、Her2、IL13Ra2、Mesothelin、PSCA、PSMA、Muc1、TAG
‑
72。9.
根据权利要求8所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
CAR
‑
T
细胞为以
CD27
为抗原结合域靶向
CD70
的
CAR
‑
T
细胞
。10.
根据权利要求9所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述抗原结合域为
CD27
的全部或部分序列，或与抗原结合域
CD27
的全部或部分序列有
85
％相同的序列，所述
CD27
的氨基酸全序列如
SEQ ID NO.6
所示
。11.
根据权利要求8所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
CAR
‑
T
细胞为以
CD30 ligand
为抗原结合域靶向
CD30
的
CAR
‑
T
细胞
。12.
根据权利要求
11
所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述抗原结合域为
CD30ligand
的全部或部分序列，或与抗原结合域
CD30 ligand
的全部或部分序列有
85
％相同的序列，所述
CD30 ligand
的氨基酸全序列如
SEQ ID NO.8
所示
。13.
根据权利要求8所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
CAR
‑
T
细胞为以
CD276 ligand
为抗原结合域靶向
CD276
的
CAR
‑
T
细胞
。14.
根据权利要求
13
所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述抗原结合域为
CD276ligand
的全部或部分序列，或与抗原结合域
CD276 ligand
的全部或部分序列有
85
％
相同的序列，所述
CD276 ligand
的氨基酸全序列如
SEQ ID NO.10
所示
。15.
根据权利要求8所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
CAR
‑
T
细胞为以
IL3
为抗原结合域靶向
CD123
的
CAR
‑
T
细胞
。16.
根据权利要求
15
所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述抗原结合域为
IL3
的全部或部分序列，或与抗原结合域
IL3
的全部或部分序列有
85
％相同的序列，所述
IL3
的氨基酸全序列如
SEQ ID NO.12
所示
。17.
根据权利要求8所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
CAR
‑
T
细胞为以
CD20
单链抗体为抗原结合域靶向
CD20
的
CAR
‑
T
细胞
。18.
根据权利要求
17
所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述抗原结合域为
CD20
单链抗体的全部或部分序列，或与抗原结合域
CD20
单链抗体的全部或部分序列有
85
％相同的序列，所述
CD20
单链抗体的氨基酸全序列如
SEQ ID NO.14
所示
。19.
根据权利要求7所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
CAR
‑
T
细胞中，
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA
表达的
tBCMA
多肽，可与
CAR
的抗原结合域直接连接形成融合蛋白
。20.
根据权利要求7所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述
CAR
‑
T
细胞中，
BCMA
胞外结构域的基因
tBCMA
表达的
tBCMA
多肽，通过连接肽与
CAR
的抗原识别区连接形成融合蛋白
。21.
根据权利要求
20
所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列包括但不限于
SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17
或
SEQ ID NO.18。22.
根据权利要求7所述的基因工程化细胞，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿声，张艳磊，
申请(专利权)人：上海雅科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：