S-制造技术

本发明专利技术公开了

【技术实现步骤摘要】
S
‑
核糖同型半胱氨酸酶LuxS突变体、工程菌及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及
S
‑
核糖同型半胱氨酸酶
LuxS
突变体
、
工程菌及制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]近年来的研究发现，细菌之间存在信号交流系统，即群体感应系统，对细菌形态变化及功能表达起着至关重要的作用
。
细菌通过群体感应系统检测周围环境中特定信号分子的浓度时刻监控着同类或异类细菌的数量和浓度变化，群体感应系统一旦检测到周围细菌的数量或者浓度达到特定值，便会通过所分泌的信号分子发出相应的信号，诱导细菌中特定基因的表达，协调改变细菌之间的行为方式，刺激菌内营养物质和代谢产物的信号传递
。
[0003]细菌群体感应系统一般由信号分子，信号识别系统以及信号识别系统诱导的不同基因组成
。
革兰氏阳性菌群体感应系统的信号分子一般是自诱导肽类物质
AIPS
，其调控过程主要包括
AIPS
的合成
、
加工
、
分泌以及细菌对
AIPS
的信号响应等
。
革兰氏阳性菌群体感应系统由自身诱导
(antoinduction
，
AI)
和双组分信号系统
(two component system
，
TCS)
组成
。
>自身诱导用于感知细胞间信息，而双组分信号系统用于接受信号分子
。
[0004]在乳酸菌中，
LuxP
‑
LuxQ
‑
LuxS
‑
HPK
‑
RR
是群体系统中主要的信号途径，调控乳酸菌对环境的适应
(
耐酸
、
耐胆盐
、
抑制致病菌
)、
生物膜的形成等
。AI
与受体蛋白
(LuxP)
结合，然后与传感器激酶
(LuxQ)
相互作用，该复合物引发磷酸化反应，诱导
LuxS
的转录，
LuxS
将其催化合成为信号交流分子呋喃酮酰硼酸二酯
(AI
‑
2)
，然后激活组氨酸蛋白激酶
(histidine protein kinase
，
HPK)
‑
应答调节蛋白
(response regulator protein
，
RR)
双组分信号转导系统，从而调控整个菌体的行为
。
[0005]乳酸菌在自然发酵过程中受到多种环境胁迫的影响
。
群体感应系统能够介导细菌生物膜的形成从而提高其环境耐受性，这可能是提高乳酸菌发酵性能的潜在调控靶点
。LuxS
的存在对于激活乳酸菌群体感应系统至关重要，但该酶及其突变体是否会影响乳酸的代谢合成以及抵抗外来环境的胁迫未为可知
。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提出了一种
S
‑
核糖同型半胱氨酸酶
LuxS
突变体
、
工程菌及制备方法和应用
。
[0007]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008]本专利技术的第一方面，涉及一种
S
‑
核糖同型半胱氨酸酶突变体，其氨基酸序列为：
[0009]SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6
或
SEQ ID NO.8。
[0010]本专利技术的第二方面，涉及一种菌株，具有用于编码上述的突变体的核苷酸序列
。
[0011]本专利技术的第三方面，涉及一种菌株的制备方法，包括以下步骤：
[0012]同源重组敲除
Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000
中
luxS
基因，获得
△
luxS
菌株；
[0013]PCR
扩增编码来自
Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 11842
的
S
‑
核糖同型半胱氨酸酶突变体基因；
PCR
的产物通过表达载体转入
△
luxS
菌株，获得
NZ9000/pMG36e
‑
luxS
工程菌株；
[0014]以重组质粒
pMG36e
‑
luxS
为模板，通过
PCR
扩增出产物，经转化处理得到的重组质粒
pMG36e
‑
luxS'
再转入
△
luxS
菌株，得到具有
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5
或
SEQ ID NO.7
的基因序列的突变株
。
[0015]本专利技术的第四方面，涉及一系列应用，包括：
[0016]上述的菌株在制备乳酸中的应用；
[0017]上述的突变体在制备乳酸中的应用；
[0018]上述的核苷酸序列在制备菌株中的应用
。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]本专利技术提供的突变体，蛋白表达水平有明显的降低，而耐酸性和
L
‑
乳酸生物合成能力却有所提高
。
本专利技术通过比较野生型和突变型菌株耐酸性和
L
‑
乳酸合成能力，结果发现本专利技术实施例中所构建的四种突变体酶菌株的乳酸合成能力分别为野生型的
1.97
，
1.38
，
1.80
和
1.34
倍，在
pH 6.0
环境下生物量分别为野生型的
1.70
，
1.63
，
1.66
，
1.55
倍
。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图
。
[0022]图1是
Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000 luxS
基因敲除的构建图谱；
[0023]图2是本专利技术定点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
S
‑
核糖同型半胱氨酸酶突变体，其氨基酸序列为：
SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6
或
SEQ ID NO.8。2.
一种菌株，具有用于编码权利要求1所述的突变体的核苷酸序列
。3.
根据权利要求2所述的菌株，其特征在于，所述菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种
。4.
一种菌株的制备方法，包括以下步骤：同源重组敲除
Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000
中
luxS
基因，获得
△
luxS
菌株；
PCR
扩增编码来自
Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 11842
的
S
‑
核糖同型半胱氨酸酶突变体基因；
PCR
的产物通过表达载体转入
△
luxS
菌株，获得
NZ9000/pMG36e
‑
luxS
工程菌株；以重组质粒
pMG36e
‑
luxS
为模板，通过
PCR
扩增出产物，经转化处理得到的重组质粒
pMG36e
‑
luxS'
再转入
△
luxS
菌株，得到具有
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5
或
SEQ ID NO.7
的基因序列的突变株
。5.
根据权利要求4所述的菌株的制备方法，其特征在于，所述的获得
△
luxS
菌株的方法包括以下步骤：将
Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000
原始菌培养至指数生长中期，提取全基因组
DNA
；将含有
P7C6
质粒的大肠杆菌
JM109
培养至指数生长中期，提取
P7C6
质粒；以
Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000
全基因组
DNA
作为左
、
右同源臂的模板；
P7C6
质粒
DNA
作为中间片段的模板，通过特异性引物进行
PCR
扩增，扩增产物融合纯化后，电转化到
Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000
感受态细胞中，得到所述的
△
luxS
菌株；其中，所述特异性引物包括：
L
‑△
luxS
‑
F:5
’‑
catgagattgacagaaaagtaatcatc
；
L
‑△
luxS
‑
R:5
’‑
cccgggtaattcgctcacttaccgc
；
△
luxS
‑
P7C6
‑
F:5
’‑
tgagcgaattacccggggatcctct
；
△
luxS
‑
P7C6
‑
R:5
’‑
ggctgagttttgtatcatatattttgttcaagcgaaaacataccacc
；
R
‑△
luxS
‑
F:5
’‑
ggtatgttttcgcttgaacaaaatatatgatacaaaactcagccgat
；
R...

【专利技术属性】
技术研发人员：周悦，刘喆，李伟，
申请(专利权)人：普立思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：