一种多突变位点的檀香烯合酶突变体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及檀香烯合酶突变酶及其在合成檀香烯中的应用。具体涉及的突变酶SanSyn(S533A)、SanSyn(S533Q)、SanSyn(Q527A&S533A)，它们分别是将第533位的丝氨酸突变为丙氨酸、谷氨酰胺以及第527位的谷氨酰胺、533位的丝氨酸均突变为丙氨酸。以葡萄糖为碳源，在宿主大肠杆菌DH5α中合成α

【技术实现步骤摘要】
一种多突变位点的檀香烯合酶突变体及其制备方法
[0001]本申请是分案申请，其原申请的中国国家申请号为202111085704.X，申请日为2021年9月16日，专利技术名称为“一种檀香烯合酶突变体及其制备方法”。


[0002]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种檀香烯合酶突变体及其制备方法。

技术介绍

[0003]檀香烯，是一种倍半萜烯，是檀香醇的前体物质。檀香烯和檀香醇是檀香精油的主要成分。檀香精油多用于化妆品和香料中，并且其具有较好的抗菌、抗氧化和抗肿瘤等药理活性。此外，檀香精油在动物体内毒性较低，无致突变性，欧美多国认为是安全的食品添加剂。
[0004]目前檀香精油主要通过植物提取法获得，但由于檀香木生长条件苛刻，生长期长，树木中檀香油含量稀少，分离过程复杂繁琐，提取困难，无法满足市场需求还会造成檀香木的大量砍伐。此外，虽然已有研究报道了由溴代樟脑为底物，经过八步化学催化反应得到檀香烯，但化学反应的条件苛刻，成本高昂，路径繁琐，要想得到产物纯品，需要对中间反应产物进行一次次的分离提纯，并非理想的大规模生产檀香烯的有效手段。因此，通过微生物细胞工厂异源生物合成檀香烯和檀香醇，这对于资源稀缺、成本高昂的的萜类化合物提供了新的可持续绿色生产方式。
[0005]萜烯生物合成的关键步骤包括通过萜烯合成酶(或环化酶类)的作用将无环的GPP、FPP、GGPP环化为单帖、倍半萜或者二萜类化合物。黄皮来源的檀香烯合酶(Santalene Synthase，SanSyn)属于植物萜烯合酶中一种，这类酶都包含相似的保守结构域DDxxD(“x”表示任意氨基酸)。目前，萜烯合酶的催化效率、对底物的特异性和稳定性等都限制着萜烯合酶的利用，我们通过对萜烯合酶的分子改造来打破这一限制。

技术实现思路

[0006]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0007]鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
[0008]因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供了一种多突变位点的檀香烯合酶突变体。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的野生型SanSyn酶的第533位丝氨酸突变为丙氨酸或谷氨酰胺得到突变体S533A或S533Q；
[0010]将核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的SanSyn酶的第527位谷氨酰胺、第533位丝氨酸均突变为丙氨酸得到突变体Q527A&S533A；
[0011]其中，所述野生型SanSyn酶来源于植物黄皮(Clausenalansium)。
[0012]作为本专利技术所述多突变位点的檀香烯合酶突变体的一种优选方案，其中：
[0013]所述多突变位点的檀香烯合酶突变体，还包括，
[0014]所述突变体S533A的核苷酸序列为如SEQ ID NO.3所示；
[0015]所述突变体S533Q的核苷酸序列为如SEQ ID NO.4所示；
[0016]所述突变体Q527A&S533A的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]本专利技术的再一目的是，克服现有技术中的不足，提供了一种多突变位点的檀香烯合酶突变体的制备方法，包括，
[0018]将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型SanSyn酶基因连接到质粒pETDuet
‑
tac中，得到重组质粒pETDuet
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tac
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SanSyn，其中，所述连接的双酶切位点分别为NcoI和BamHI，所述质粒pETDuet
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tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0019]设计突变引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.11所示的突变引物S533A
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F、S533
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R、S533Q
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F、Q527A&S533A
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F、Q527A&S533A
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R；
[0020]其中，所述引物S533A
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F和S533
‑
R用于获得突变体S533A；
[0021]引物S533Q
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F和S533
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R用于获得突变体S533Q；
[0022]引物Q527A&S533A
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F和Q527A&S533A
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R用于获得突变体Q527A&S533A；
[0023]使用突变引物并以质粒pETDuet
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tac
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SanSyn为模板进行PCR扩增分别得到不同位点的突变产物，转化到宿主细胞大肠杆菌TOP 10的感受态细胞中，筛选得到檀香烯合酶SanSyn突变体表达菌株，诱导表达，得到多突变位点的檀香烯合酶突变体。
[0024]本专利技术有益效果：
[0025]S533A突变菌株在诱导后发酵培养3天后α
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檀香烯浓度达到1028mg/L，较未突变菌株产量提高1.9倍，S533Q突变菌株α
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檀香烯最终浓度达到959mg/L，Q527A&S533A双点突变菌株α
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檀香烯浓度达到815mg/L，较未突变菌株浓度相比均有所提高，且SanSyn的突变体S533Q的可溶性蛋白表达也得到提高。
[0026]本专利技术提供了含有所述的檀香烯合酶编码基因的重组菌株，并通过定点突变SanSyn基因，提高了α
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檀香烯的积累量，并且提高了可溶性蛋白表达。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0028]图1为SanSyn酶的三维结构模拟图。
[0029]图2为实施例2中重组菌在24h、48h、72h时的α
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檀香烯产量。
[0030]图3为实施例2中重组菌包含质粒。
[0031]图4为实施例4中檀香烯合酶突变体可溶性蛋白相对表达。
具体实施方式
[0032]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对
本专利技术的具体实施方式做详细的说明。
[0033]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用不同于在此本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多突变位点的檀香烯合酶突变体，其特征在于：包括，将核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的野生型SanSyn酶的第533位丝氨酸突变为丙氨酸或谷氨酰胺得到突变体S533A或S533Q；将核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的SanSyn酶的第527位谷氨酰胺、第533位丝氨酸均突变为丙氨酸得到突变体Q527A&S533A；其中，所述野生型SanSyn酶来源于植物黄皮(Clausenalansium)。2.如权利要求1所述的多突变位点的檀香烯合酶突变体，其特征在于：所述多突变位点的檀香烯合酶突变体，还包括，所述突变体S533A的核苷酸序列为如SEQ ID NO.3所示；所述突变体S533Q的核苷酸序列为如SEQ ID NO.4所示；所述突变体Q527A&S533A的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.权利要求2所述的多突变位点的檀香烯合酶突变体的制备方法，其特征在于：所述制备方法，包括，将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型SanSyn酶基因连接到质粒pETDuet
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tac中，得到重组质粒pETDuet
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tac
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SanSyn，其中，所述连接的双酶切位点分别为NcoI和BamHI，所述质粒pETDuet
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【专利技术属性】
技术研发人员：李迅，张佳，王询，王飞，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：