一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法及试剂盒，以含有

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术是一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法及试剂盒，具体涉及细菌葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法及试剂盒，属于生物催化

。

技术介绍

[0002]为检测葡萄糖基转移酶的活性，目前通常是采用酶谱法
。
其操作过程是先将样品进行十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺（
SDS
‑
PAGE
，含
0.1
％明胶）凝胶电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的葡萄糖基转移酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带颜色的深浅与葡萄糖基转移酶活性成正比
。
该方法存在的缺陷包括：（1）检测方法实验周期长，一般需要2～3天；（2）操作过程较为复杂，涉及到
SDS
‑
PAGE
凝胶电泳等多个操作步骤，对实验结果的影响因素较多；（3）孵育液中含剧毒药品，具备一定风险性；（4）蛋白酶的活性对实验结果影响较大，结果为图像数据，难以定量分析；（5）受到电泳等实验环节限制，难以实现葡萄糖基转移酶抑制剂的快速和高通量筛选
。
[0003]现有技术中，公开号为
CN104178554A
的专利技术专利公开了羟甲唑啉作为葡萄糖醛酸转移酶
UGT1A9 专属性底物的应用，通过采用羟甲唑啉作为底物，将其在生物体系中进行葡萄糖醛酸化反应，通过定量测定单位时间内底物的消除量或者葡萄糖醛酸化产物的生成量来测定生物体系中的
UGT1A9
酶活性
。
以及公开号为
CN112695070A
的专利技术专利公开了一种糖基转移酶活性测定新方法，该方法通过构建
UDP
‑
葡萄糖依赖糖基转移酶与蔗糖合酶的偶联反应体系，利用
DNS
显色法检测双酶偶联反应产生的果糖，从而建立基于颜色反应的糖基转移酶的活性检测或筛选方法，具有操作简便
、
成本低，通量高等优点，可用于
UDP
‑
葡萄糖依赖糖基转移酶的活性测定
、
新型
UDP
‑
葡萄糖依赖糖基转移酶的筛选
、UDP
‑
葡萄糖依赖糖基转移酶突变的活性筛选等方面
。
上述专利中，由于羟甲唑啉具有高度的
UGT 代谢酶选择性（只由
UGT1A9
代谢），而
UDP
‑
葡萄糖依赖糖基转移酶与蔗糖合酶构建的偶联反应体系也仅适用于
UDP
‑
葡萄糖依赖糖基转移酶的活性检测，因此，在除
UGT1A9
和
UDP
外的葡萄糖基转移酶活性检测时，是否仍然能够发挥其反应活性，还有待实验证明
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法，该方法以蔗糖作为唯一底物，
T70
葡聚糖作为后续生产的聚糖链接载体，通过葡聚糖转移酶与蔗糖反应生成葡聚糖，并通过其吸光度值来反映葡聚糖转移酶的活性，适用于多种葡聚糖转移酶的活性简单，具有检测周期短
、
操作流程简单
、
检测结果准确
、
无毒无污染等诸多优点，明显优于现有酶谱法的检测流程，具有良好的应用前景
。
为此，本专利技术还提供了一种快速检测葡萄糖基转移酶活性的试剂盒
。
[0005]本专利技术通过下述技术方案实现：一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法，以含有
T70
葡聚糖和蔗糖的磷酸钠缓冲液为底物，加入待检测的葡萄糖基转移酶进行反应，测定
终产物葡聚糖的吸光度值，从而获得葡萄糖基转移酶的酶活性
。
[0006]将所述底物中
T70
葡聚糖的质量浓度控制在
0.2%。
[0007]将所述底物中蔗糖的质量浓度控制在
2.5%。
[0008]所述待检测的葡萄糖基转移酶为变异链球菌中的葡糖基转移酶，包括
GtfBCD、GtfB、GtfC
或
GtfD。
[0009]所述底物中，待检测的葡萄糖基转移酶的加入量控制在
22.5
～
45
μ
g。
[0010]所述反应时，控制反应体系的
pH
为6～7，反应温度为
37℃
，反应时间为
10
～
12h。
[0011]向所述反应体系中加入
NaOH
和
/
或
HCl
，来调节反应体系的
pH
值
。
[0012]所述吸光度值为
540nm
下终产物葡聚糖的最大吸光度值
。
[0013]本专利技术还提供了一种快速检测葡萄糖基转移酶活性的试剂盒，包含检测试剂，所述检测试剂为含有
T70
葡聚糖和蔗糖的磷酸钠缓冲液
。
[0014]进一步的，所述检测试剂中，
T70
葡聚糖的质量浓度控制在
0.2%
，蔗糖的质量浓度控制在
2.5%。
[0015]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：（1）本专利技术方法明显优于现有酶谱法的检测流程，具有检测时间短
、
操作流程简单
、
实验周期短
、
使用试剂无毒无污染的优点，具体而言，
A.
酶谱法检测所需时间较长，需要进行制胶
、SDS
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳
、
脱色
、
染色等步骤，实验周期一般需要2～3天；而本专利技术方法耗时较短，一般在
10h
左右
。
葡萄糖基转移酶以蔗糖为唯一底物，生成葡聚糖的产量以吸光度值来表现，反应大概在
10h
左右进入拐点，后续变化幅度较小
。
[0016]B.
酶谱法操作较为复杂，涉及到
SDS
‑
PAGE
凝胶电泳等操作过程，需要进行培训和学习才能完成实验；而本专利技术法操作简便，易于实现，且结果易于统计分析，更不需进行
SDS
‑
PAGE
凝胶电泳，可以在普通的
96
孔板里实现，通过加入底物和酶来实现反应
。
[0017]C.
酶谱法实验周期较长，且一次操作只能加入几个样品，难以实现高通量的快速筛选；而本专利技术方法实验周期短，且可以实现高通量的快速筛选，实际操作时，可在
96
孔板里进行筛选，一个孔板里可以添加几十个反应，操作时可以多个孔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法，其特征在于：以含有
T70
葡聚糖和蔗糖的磷酸钠缓冲液为底物，加入待检测的葡萄糖基转移酶进行反应，测定终产物葡聚糖的吸光度值，从而获得葡萄糖基转移酶的酶活性
。2.
根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：将所述底物中
T70
葡聚糖的质量浓度控制在
0.2%。3.
根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：将所述底物中蔗糖的质量浓度控制在
2.5%。4.
根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：所述待检测的葡萄糖基转移酶为变异链球菌中的葡糖基转移酶，包括
GtfBCD、GtfB、GtfC
或
GtfD。5.
根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：所述底物中，待检测的葡萄糖基转移酶的加入量控制在
22.5
～
45
μ
g。6.
根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雨庆，徐迈，马其钊，邹静，周学东，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：