一种检测宫颈上皮细胞端粒酶活性的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，为了解决目前端粒酶检测技术依然无法应用于宫颈癌筛查中的问题，提供了一种检测宫颈上皮细胞端粒酶活性的试剂盒及其应用。所述试剂盒包含磁珠、端粒酶释放溶液、定量PCR试剂，其中磁珠偶联了抗人GYPC基因编码蛋白的抗体；该试剂盒使用抗人GYPC基因编码蛋白的抗体磁珠从宫颈脱落细胞中分离并富集上皮细胞，经过一步裂解释放细胞内端粒酶，通过端粒酶延伸和定量PCR单管偶联反应检测端粒酶活性。本试剂盒的采样方法去除了宫颈刷采样带来的杂质以及大部分非上皮来源的细胞，减少了干扰端粒酶检测的杂质，可适用于检测高危HPV感染的上皮病变细胞。适用于检测高危HPV感染的上皮病变细胞。适用于检测高危HPV感染的上皮病变细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种检测宫颈上皮细胞端粒酶活性的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种检测宫颈上皮细胞端粒酶活性的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]端粒酶是一种以自身RNA为模板，合成端粒DNA的逆转录酶，主要由端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白和端粒酶逆转录酶组成[1]，是维持细胞增殖的主要参与者，主要是维持端粒的长短，减慢端粒缩短的速度。端粒酶的激活是人类癌症的一个重要特征，大多数体细胞不显示端粒酶的活性，而85%~90%的肿瘤细胞都存在端粒酶活性的增高[2]。研究发现，端粒酶的激活在宫颈癌变的过程是中一个相对较早的阶段，端粒酶活性可作为宫颈癌患者诊断和预后的有潜在标志物[3]。
[0003]端粒酶检测技术应用较多的为Kim等人，最早提出的端粒重复扩增分析法(Telomeric repeat amplification protocol assay，TRAP)[4]，以及一些以TRAP为基础结合自身改良而成的[5]，敏感程度较高，但多为定性检测，无法判断端粒酶活性程度，且TRAP方法容易受到细胞提取物的抑制，步骤比较复杂，限制了在临床的应用。有研究提出，利用荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）来做TRAP实验，实现半定量分析[6]，但检测结果和端粒酶之间无法建立准确的线性关系。随着对端粒酶检测技术的不断探索，出现如电化学法、化学反应发光法、荧光分析法、可视化检测法等新的端粒酶检测技术，但存在一些酶易降解、信号不稳、步骤复杂、灵敏度较低等问题[7]。因此，目前端粒酶检测技术尚没能广泛用于宫颈癌的筛查。
[0004]参考文献：[1] Armstrong CA and Tomita K.Fundamental mechanisms of telomerase action inyeasts and mammals: understanding telomeres and telomerase in cancer cells[J].Open Biol,2017,7(3):160338.[2]Shawi M and Autexier C.Telomerase, senescence and ageing[J].Mech Ageing Dev,2008,129(1
‑
2):3
‑
10.[3]Jiang J, Wei LH, Li YL, et al.Detection of TERC amplification in cervical epithelial cells for the diagnosis of high
‑
grade cervical lesions and invasive cancer:a multicenter study in China[J].J Mol Diagn,2010,12(6):808
‑
817.[4]Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266(5193):2011
‑
2015.[5]张莉萍, 蒋纪恺,刘祥贵.聚合酶链反应检测肿瘤细胞株的端粒酶活性[J].中华医学检验杂志, 1998,(03):10
‑
12.[6]许争峰, 胡娅莉,王迅美,等.TRAP—ELISA法进行端粒酶半定量检测[J].中国
优生与遗传杂志,2001,03:30
‑
31.[7]郭玥,吴霞,夏帆,等.端粒酶活性检测研究进展[J].分析测试学报,2021,40(12):1819
‑
1826。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决目前端粒酶检测技术依然无法应用于宫颈癌筛查中的问题，提供了一种检测宫颈上皮细胞端粒酶活性的试剂盒及其应用。
[0006]本专利技术由如下技术方案实现的：一种检测宫颈上皮细胞端粒酶活性的试剂盒，所述试剂盒包含磁珠、端粒酶释放溶液、定量PCR试剂，其中磁珠偶联了抗人GYPC基因编码蛋白的抗体；所述端粒酶释放溶液为：10 mM、pH 7.5的Tris
‑
HCl，1.5 mM MgCl2，1 mM 钙离子螯合剂EGTA，0.5% m/V 的蛋白质裂解液CHAPS，10%v/v的甘油，5 mM 二硫苏糖醇DTT，0.5 mM 丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF，1 U/
µ
L RNA酶抑制剂，0.4 mg/mL 牛血清白蛋白BSA。
[0007]所述定量PCR试剂为：2
×
PCR mix 10
µ
L，5
ꢀµ
M Iso
‑
STS引物0.8
µ
L，0.8
µ
L 5
µ
M的ACX引物，2
µ
L细胞裂解液、6.4
µ
L水。
[0008]本专利技术还提供了所述的试剂盒在宫颈癌筛查中的应用。
[0009]奔赴吗还提供了所述的试剂盒在监测宫颈上皮细胞病变进程中的应用。
[0010]本专利技术所述磁珠可以从宫颈脱落细胞中分离上皮细胞。所述端粒酶释放溶液可以裂解磁珠分离的上皮细胞，释放出端粒酶。所述定量PCR试剂可以在同一反应溶液中进行端粒酶延伸反应以及反应产物的定量PCR检测。本专利技术中所采用的ACX引物为申请号为201911357551.2、专利技术名称为用于检测端粒酶活性的引物组及检测方法中的ACX引物。
[0011]与现有技术相比，本专利技术的采样方法去除了宫颈刷采样带来的杂质以及大部分非上皮来源的细胞，减少了干扰端粒酶检测的杂质，可适用于检测高危HPV感染的上皮病变细胞。探针法单细胞或多细胞端粒酶活性检测技术应用于宫颈癌的筛查，能显著提高宫颈癌筛查的灵敏度、特异度。端粒酶活性检测技术作为HPV检测、TCT检测的一种补充方式也可提高宫颈高级别癌前病变筛查的特异度。端粒酶活性检测技术应用于宫颈癌的筛查具有较好的可行性。
附图说明
[0012]图1为宫颈癌的ROC曲线；图中：A为端粒酶活性检测宫颈癌的ROC曲线（AUC=0.931），B为HPV检测宫颈癌的ROC曲线（AUC=0.638），C为TCT检测宫颈癌的ROC曲线（AUC=0.748）；图2为PCR扩增曲线图；图中A为无宫颈病变组的扩增曲线，B为低级别上皮内瘤变组CIN I组的扩增曲线，C为高级别上皮内瘤变组CIN II组的扩增曲线，D为宫颈癌组CIN III的扩增曲线；图3为端粒酶活性半定量检测结果分析；图中：A为不同宫颈病变Ct分布图，B为宫颈癌前病变组与宫颈癌组的端粒酶活性比较，C为CIN III组与宫颈癌组的端粒酶活性比较；图4为宫颈癌ROC曲线；
PBS，吹打均匀，60本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测宫颈上皮细胞端粒酶活性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含磁珠、端粒酶释放溶液、定量PCR试剂，其中磁珠偶联了抗人GYPC基因编码蛋白的抗体；所述端粒酶释放溶液为：10 mM、pH 7.5的Tris
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HCl，1.5 mM MgCl2，1 mM 钙离子螯合剂EGTA，0.5% m/V 的蛋白质裂解液CHAPS，10%v/v的甘油，5 mM 二硫苏糖醇DTT，0.5 mM 丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF，1 U/
µ
L RNA酶抑制剂，0.4 mg/mL 牛血清白蛋白BSA。2.根据权利要求1所述的一种检测宫颈上皮细胞端粒酶活性的试剂盒，其特征在于：所述定量PCR试剂为：2
×
...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑金平，杨丹丹，谭铮，郑克威，王佳，
申请(专利权)人：长治医学院，
类型：发明
国别省市：