一种检测鲟鱼嗜水气单胞菌的制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体为鲟鱼嗜水气单胞菌的检测技术

【技术实现步骤摘要】
一种检测鲟鱼嗜水气单胞菌的RPA引物对、探针和试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及鲟鱼嗜水气单胞菌的检测技术，具体为于检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA
引物和探针
、
试剂盒及其在检测鲟鱼嗜水气单胞菌方面的应用
。

技术介绍

[0002]中华鲟
(Acipenser sinensis)
是一种大型溯河产卵的江海洄游性鱼类，为我国国家一级重点保护野生动物，
IUCN
极危级
(CR)
物种
。
自
2013
年以来，已经连续多年未监测到中华鲟的自然繁殖
。
尽管
2013
年和
2015
年在长江口监测到降河的中华鲟幼鱼，但不可否认该物种的野外种群量已经达到了极其濒危的程度
。
人工保种已经成为延续该物种的重要途径
。
然而近年来发现人工养殖的中华鲟病害频发
,
为物种的保护带来相当大的困难
。
[0003]鲟鱼感染嗜水气单胞菌会引起急性败血症和肠炎病，迅速导致鱼体大量死亡和造成巨大的经济损失
。
近年来，在鲟鱼养殖业中嗜水气单胞菌的感染已成为一个重要的问题
。
检测嗜水气单胞菌的常规技术包括培养鉴定和免疫诊断
。
这些技术既费力又耗时，而且高度依赖于实验室仪器
。
在过去的十年中，基于聚合酶链反应
>(PCR)
以及实时
PCR(qPCR)
的技术已广泛应用于嗜水气单胞菌的检测
。
它们比传统技术更敏感和特异，通常在几个小时内得出结果
。
然而，在资源有限的条件下，对复杂的热循环仪器和训练有素的人员的需求限制了嗜水气单胞菌现场检测方法的使用
。
因此，目前迫切需要一种能够快速方便地检测这种病原体的技术
。
[0004]重组酶聚合酶扩增
(recombinase polymerase amplification,RPA)
技术因其快速
、
简便
、
特异性和敏感性好而备受关注
。
该技术利用重组酶进行
DNA
链打开和引物配对，利用置换链聚合酶进行链延伸
。
由于酶导链开链不需要高温，因此不需要温度循环，
RPA
反应在恒定低温下进行，通常在
37
～
42℃
之间
。RPA
产物可以与侧向流动免疫层析试纸条
(Lateral flow device
，
LFD
，测流层析试纸条
)
相结合，进一步简化嗜水气单胞菌的检测，直接用肉眼在
LFD
上读取彩色信号
。
将
LFD
与
RPA
相结合，与已经开发了几种嗜水气单胞菌的检测方法相比，
RPA
‑
LFD
技术可以消除了热循环器的使用，增加现场检测鲟鱼嗜水气单胞菌的便利性
。
[0005]因此，需要对现有技术加以改进，以实现用
RPA
‑
LFD
技术快速检测鲟鱼嗜水气单胞菌
。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供基于
RPA
技术检测鲟鱼嗜水气单胞菌的试剂盒及其专用引物和探针
。
[0007]本专利技术技术方案如下：
[0008]一种用于检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA
引物对，其上下游引物的核苷酸序列包括
SEQ ID No.1
和
SEQ ID No.2
所示的序列
。
[0009]SEQ ID No.1
：5’‑
tcttcagcgataccctgttccactacgagatcct
‑3’
；
[0010]所述下游引物
RPA
‑
gyrB
‑
R3
的序列为：
[0011]SEQ ID No.2
：5’‑
gtattcgacgaacgccttgatgccgccttc
‑3’
。
[0012]所述的引物对序列是根据鲟鱼嗜水气单胞菌
gyrB
基因设计的，且所述鲟鱼嗜水气单胞菌检测目标基因序列为：
[0013]cgcaacggccatgtctacgagcagacctatcacctgggtgagccgcaggcaccgctcaagcagattggcgacagcaccggcaccgggaccgaagtccgcttctggccgagcccgaccatcttcagcgataccctgttccactacgagatcctggccaagcgtctgcgcgagctctccttcctcaactccggcgtctccatccgcctgctggatgagcgtgacggccgcgaggcgcacttctgctacgaaggcggcatcaaggcgttcgtcgaatacctgaaccagaacaaaaccccgatccacccgaaggtgttccacttcaccaccgagcaggacggcat
[0014]进一步，下游序列的5’
端用生物素标记
。
[0015]优选的，其上下游核苷酸序列如
SEQ ID No.1
和
SEQ ID No.2
所示
。
[0016]本专利技术还提供了一种检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA
探针
。
该探针
(
用
RPA
‑
gyrB
‑
P
表示
)
的核苷酸序列含有
SEQ ID No.3
所示的序列
。
[0017]SEQ ID No.3
：
ccaagcgtctgcgcgagctctccttcctcaatccggcgtctcca tc
[0018]进一步，在该序列的5’
端有荧光基团
FAM
，3’
端有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团
C3
‑
Spacer
，在序列的第
31
位和第
32
位之间连接有脱碱基位点类似物四氢呋喃
(THF)。
[0019]优选的，所述探针的核苷酸序列如
SEQ ID No.3
所示
。
[0020]优选的，所述探针序列为：
(FAM)ccaagcgtctgcgcgagctctccttcc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA
引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，上下游引物的核苷酸序列分别包括
SEQ IDNo.1
和
SEQ ID No.2
所示的序列，且下游引物的5’
端标记生物素
。2.
根据权利要求1所述用于检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA
引物对，其特征在于，上下游引物的核苷酸序列分别如
SEQ ID No.1
和
SEQ ID No.2
所示
。3.
一种用于检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA
探针，其特征在于，其核苷酸序列包括
SEQ ID No.3
所示的序列
。4.
根据权利要求3所述用于检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA
探针，其特征在于，其核苷酸序列如
SEQ ID No.3
所示
。5.
根据权利要求3或4所述用于检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA
探针，其特征在于，其5’
端有荧光基团
FAM
，3’
端有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团
C3
‑
Spacer
，在
SEQ ID No.3
序列的第
31
位和第
32
位之间连接有四氢呋喃
。6.
一种快速检测鲟鱼嗜水气单胞菌的
RPA...

【专利技术属性】
技术研发人员：许丹，王姝然，郑跃平，徐嘉楠，范厚勇，刘兴旺，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：