一种提升核酸质谱检测结核耐药包容性的试剂盒及其应用制造技术

本公开提供一种运用核酸质谱平台检测结核耐药位点的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括3组独立包装的引物组，所述第1组引物组包括

【技术实现步骤摘要】
一种提升核酸质谱检测结核耐药包容性的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分子诊断
，具体涉及一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
(MALDI
‑
TOF)
平台的用于结核分枝杆菌耐药突变位点检测的引物优化方式，经优化后的引物菌株包容性更高
。

技术介绍

[0002]耐多药结核病
(multidrug
‑
resistant tuberculosis,MDR
‑
TB)
是全球及我国主要的公共卫生问题之一
。
据
2021
年
WHO
估计，中国耐多药
/
利福平耐药结核病
(MDR/RR
‑
TB)
患者数位居全球前七，超过1万例
。
因此快速准确鉴定
MDR
‑
TB
患者，对指导早期临床用药
、
提高治愈率具有重要意义
。
目前，表型药敏试验
(drug susceptibility testing,DST)
被认为是结核分枝杆菌
(Mycobacterial tuberculosis,MTB)
耐药检测的金标准，但此方法操作繁琐且耗时长
(10d
至4周
)
，在此期间患者极有可能被不合理用药，反而增加耐药风险
。
分子药敏检测
(molecular drug susceptibility testing,mDST)
可以实现耐药结核病的快速诊断，但检测的敏感性依赖于检测耐药突变位点的数量
。
由于目前快速诊断方法只能检测数量有限的耐药突变位点，而耐药突变谱
(
突变类型及突变频率
)
存在地区差异，因此，开发一种可以尽可能多地涵盖不同地区
MTB
的耐药突变谱的检测方法，选择合适的耐药突变位点组合，对于提高
mDST
的敏感性具有重要意义
。
[0003]核酸质谱检测系统基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
‑
Time of Flight
，
MALDI
‑
TOF)
，作为基因检测领域的一个中通量技术，检测范围广，可了解突变的位点和性质，一次性检测同时完成结核分枝杆菌多种药物耐药突变检测，具有高准确率和高灵敏度
。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time
‑
of
‑
flight Mass Spectrometry
，
MALDI
‑
TOF MS)
的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相
。MALDI
所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有对应关系，并以质
/
荷比计算分子量
。MALDI
产生的离子常用飞行时间
(Time
‑
of
‑
Flight,TOF)
检测器来检测，最后根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比
(M/Z)
与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量
。MALDI
‑
TOF
质谱很适合用于对蛋白质
、
多肽和多糖
、
核酸等生物大分子的研究
。
因其具有测定质量范围宽
、
灵敏度高
、
速度快
、
精确度高及对盐的耐受性较好等优点，已广泛应用于蛋白质及多肽的分子量和序列测定
。
[0004]目前国内外已有运用
MALDI
‑
TOF
技术对结核耐药基因位点检测的研究报道，对比现有的研究结果，本专利技术的创新性体现在开发一种提升核酸质谱检测结核耐药包容性的试剂盒
。
[0005]本专利技术存在的难点：各检测靶点的扩增引物
(
即多重
PCR
引物
)
和延伸引物设计，
rpoB
基因相关的耐药突变位点碱基距离较近，是多重质谱引物设计的一个难点；人结核分
枝杆菌自身基因组
GC
含量高达
65.6
％，扩增片段
GC
含量会影响
PCR
扩增效率，是多重质谱引物设计的第二个难点；对整个核酸质谱引物体系的优化，使其尽可能多地覆盖检测不同基因型的结核分枝杆菌株系，体现更强的包容性，是多重质谱引物设计的第三个难点
。

技术实现思路

[0006]本专利技术基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
(MALDI
‑
TOF)
检测平台，运用核酸质谱技术，开发一种提升核酸质谱检测结核耐药引物包容性的优化方法
。
本专利技术创造性地提出将各检测位点分成3组，通过合理的分组，可以避免相互之间干扰，从而可以3管反应完成全部位点的检测，实现以较低成本一次性获得其全部菌种耐药突变位点信息，避免反复检测造成的经济负担
。
同时，针对不同基因型的菌株株系，设计特异性结合的延伸引物，兼容更多的菌株类型，为研究适合我国临床流行菌株特点的耐药突变位点组合，提高
mDST
的灵敏度，精准地指导临床用药提供了一种检测较全面的技术方法
。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：3组用于结核分枝杆菌耐药突变位点检测区域扩增的引物序列，包括如下表所示引物：
[0008][0009][0010]本专利技术提供第二种技术方案：3组用于结核分枝杆菌耐药突变位点检测的单碱基延伸检测的引物序列，针对不同株系的菌株设计特异性延伸引物，包括如下表所示引物：
[0011][0012][0013][0014]本专利技术的第三种技术方案为：一种用于结核分枝杆菌耐药突变位点检测的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
[0015](1)
飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：包括如下主要组分
[0016]试剂组成组分
PCR
反应混合液含
PCR
缓冲液
、Mg
2+
、dATP、dCTP、dTTP、dUTP
和
dGTP
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种核酸质谱检测结核耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括3组独立包装的引物组，所述第1组引物组包括
SEQ ID No.1
‑
26
所示的引物，第2组引物组包括
SEQ ID No.27
‑
54
所示的引物，第3组引物组包括
SEQ ID No.55
‑
76
所示的引物
。2.
根据权利要求1所述的试剂盒，所述第1组引物组还包括
SEQ ID No.77
‑
97
所示的单碱基延伸引物
。3.
根据权利要求1所述的试剂盒，所述第2组引物组还包括
SEQ ID No.98
‑
125
所示的单碱基延伸引物
。4.
根据权利要求1所述的试剂盒，所述第3组引物组还包括
SEQ ID No.126
‑
149
所示的单碱基延伸引物
。5.
根据权利要求1‑4任意一项所述的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)
飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：包括如下主要组分试剂组成组分
PCR
反应混合液含
PCR
缓冲液
、Mg
2+
、dATP、dCTP、dTTP、dUTP
和
dGTP
等
PCR
酶混合液含
Taq
酶及
UNG
酶
SAP
反应混合液含
SAP
缓冲液
SAP
酶混合液含
SAP
酶
、
酶保存液延伸反应混合液含延伸缓冲液
、Mg2+、ddATP、ddCTP、ddTTP、ddGTP
等延伸酶混合液含延伸酶
、
...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雁林，张郁，欧喜超，郭惠民，康桃，陈琦，张盼，赵冰，黄飞，王倪，李涛，胡志刚，
申请(专利权)人：浙江迪谱诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：