同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的方法及引物组技术

本申请涉及同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的方法及引物组，该方法包括如下步骤：使用核苷酸序列如

【技术实现步骤摘要】
同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的方法及引物组


[0001]本申请涉及分子生物学领域，具体涉及同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的方法及引物组
。

技术介绍

[0002]地衣芽孢杆菌
(Bacillus licheniformis)
和副地衣芽孢杆菌
(Bacillus paralicheniformis)
在进化关系上属于近源菌种，两者在生物
被广泛用以生产抗菌物质
、
生化制剂
、
酶等
。
芽孢杆菌抗逆性强，在营养缺乏
、
干燥
、
高温等条件下可形成芽孢，在条件适宜时又可重新萌发为营养体进行增殖
。
鉴于地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的应用价值和强抗逆性，在食品微生物安全检测中经常出现二者的身影
。
[0003]目前国标法菌落总数检测
(GB4789.2)
对地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的检测通常需要
48
小时，检测效率较低
。
传统培养基的改良通过显色反应缩短了培养时间，但仍需
18
‑
24
小时；固相基因芯片对地衣芽孢杆菌等菌种的检测则操作繁琐，需配套较多专业设备，检测成本高
。A.K.Olajide
等研究者发表的基于副地衣芽孢杆菌特异基因
fenC
和
fenD
序列的
PCR
检测方法可快速区分和鉴定副地衣芽孢杆菌，但在食品微生物安全检测中，分别检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌会造成检测成本的增加和效率的降低
。
[0004]目前，需要开发一种可同时快速检测样本中地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的方法和试剂盒
。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种灵敏度高
、
特异性好的检测引物及试剂盒，实现对地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的同时检测
。
[0006]具体技术方案如下：
[0007]一种同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：
[0008]使用核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示的第一引物和核苷酸序列如
SEQ IDNo.2
所示的第二引物对待测样本
DNA
进行检测，根据检测结果判断待测样本中是否含有地衣芽孢杆菌和
/
或副地衣芽孢杆菌
。
[0009]在其中一个实施例中，所述检测方法包括实时荧光定量
PCR
方法
。
[0010]在其中一个实施例中，所述待测样本包括调味品
。
[0011]在其中一个实施例中，检测的反应体系包括
DNA
聚合酶
、dNTP、PCR
缓冲液
、
核酸染料
、
各引物和待测样本
DNA。
[0012]在其中一个实施例中，检测的反应条件包括：
[0013](1)
预变性：
95℃3min
；
(2)
循环反应：
95℃10s
，
65℃30s
，共
35
～
45
个循环
。
[0014]一种用于同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的引物组，所述引物组包括第一引物和第二引物，其中，所述第一引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示，所述第二引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.2
所示
。
[0015]一种用于同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组
。
[0016]在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸扩增所用的其他试剂
、DNA
提取试剂
、
阳性对照品和阴性对照品中的至少一种
。
[0017]在其中一个实施例中，所述核酸扩增所用的其他试剂包括
DNA
聚合酶
、dNTP、
核酸染料和
PCR
缓冲液中的一种或多种
。
[0018]在其中一个实施例中，所述
DNA
提取试剂包括溶菌酶
、
蛋白酶
K
和菌体消化液
。
[0019]在其中一个实施例中，所述阳性对照品包括地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌纯培养液提取的
DNA。
[0020]在其中一个实施例中，所述阴性对照品包括无菌去离子水
。
[0021]所述的引物组在制备同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的产品中的应用
。
[0022]相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
[0023]本申请基于核苷酸序列如
SEQ ID No.1
～2所示的引物组提供了一种用于同时检测待测样本中地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的方法，该方法具有灵敏度高
、
准确性高
、
操作简单且检测时间短等优点，同时该方法能提高食品微生物安全检测效率并降低成本
。
其中，该引物组具有特异性强
、
灵敏性高及稳定性好等优点
。
附图说明
[0024]图1为引物组特异性检测结果，其中图1中的
A
：地衣芽孢杆菌检测结果；图1中的
B
：副地衣芽孢杆菌检测结果；
[0025]图2为引物组特异性筛选结果，图2中的
A
：地衣芽孢杆菌和阴性对照检测结果；图2中的
B
：副地衣芽孢杆菌和阴性对照检测结果；
[0026]图3为调味品样本中引物组稳定性和灵敏度筛选结果，图3中的
A
：地衣芽孢杆菌和阴性对照检测结果；图3中的
B
：副地衣芽孢杆菌和阴性对照检测结果；
[0027]图4为不同菌株的实时荧光定量
PCR
扩增曲线；
[0028]图5为地衣芽孢杆菌不同菌浓度样本和阴性对照的实时荧光定量
PCR
扩增曲线；
[0029]图6为地衣芽孢杆菌
Cq
值与菌量呈线性相关图；
[0030]图7为副地衣芽孢杆菌不同菌浓度样本和阴性对照的实时荧光定量
PCR
扩增曲线；
[0031]图8为副地衣芽孢杆菌
Cq
值与菌量呈线性相关图；
[0032]图9为地衣芽孢杆菌阳性调味品样本实例检测结果；
[0033]图
10
为副地衣芽孢杆菌阳性调味品样本实例检测结果；
[0034]其中，图1～图5及图
7、
图9～图
10...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种同时检测地衣芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：使用核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示的第一引物和核苷酸序列如
SEQ IDNo.2
所示的第二引物对待测样本
DNA
进行检测，根据检测结果判断待测样本中是否含有地衣芽孢杆菌和
/
或副地衣芽孢杆菌
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法采用实时荧光定量
PCR
方法
。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括调味品
。4.
根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，检测的反应体系包括
DNA
聚合酶
、
各引物
、dNTP、
核酸染料
、PCR
缓冲液和待测样本
DNA。5.
根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，检测的反应条件包括：
(1)
预变性：
95℃3min
；
(2)
循环反应：
95℃10s
，
65℃30s
，共
35
～
45
个循环
。6.
一种用于同时检测地衣芽孢...

【专利技术属性】
技术研发人员：方佩，胡桂平，邓磊，李贤信，
申请(专利权)人：广东规正质量检测有限公司，
类型：发明
国别省市：