本发明专利技术公开了一种精子核DNA完整性检测试剂盒，属于体外诊断试剂技术领域。本发明专利技术公开的一种精子核DNA完整性检测试剂盒，包括：裂解液、变性液、SCD浓缩洗涤液(20X)、低熔点琼脂糖管、预处理载玻片、染色剂A液、染色剂B液、SCD保存液。本发明专利技术提供反应体系完整的规范化试剂盒，操作流程标准化，便于操作者准确掌握；试剂的配方更加完整，测试效果显著提高；本试剂盒配方中无昂贵原材料，成本较低，便于普及，造福患者；不需要使用昂贵仪器，只需使用普通显微镜就能测试，测试成本低。测试成本低。测试成本低。
【技术实现步骤摘要】
一种精子核DNA完整性检测试剂盒
[0001]本专利技术涉及体外诊断试剂
，更具体的说是涉及一种精子核DNA完整性检测试剂盒。
技术介绍
[0002]10～15％的育龄夫妇患有不孕不育症，这与遗传、生态环境、内分泌等多种因素密切相关，而由男性精子质量下降引起者约占不孕不育人群的一半，常规的精液分析能够从精子密度、精子活力和精子形态等方面反映精液质量，但是其在精子功能的评价方面价值有限，不能直接反映精子受精能力和对胚胎发育的影响。
[0003]近年来的研究表明精子DNA的完整性与精子活力、精子形态及精子功能有显著相关性，并且可以影响受精卵的分裂以及胚胎的发育。DNA损伤的精子比例在30％以上就可能是男性不育的重要因素，有时虽可以受孕发育成胚胎，但多在早期发生自然流产。精子DNA是遗传信息的载体，但是精子生成过程中染色质的浓缩异常、受损精原细胞的凋亡、异常环境毒物以及不良的生活习惯都会造成精子DNA损伤。
[0004]精子染色质具有由DNA双链和碱性鱼精蛋白相结合形成的高度浓缩的特殊结构，这种结构的形成涉及精子发生中的核蛋白组型转换、二硫键交联等一系列过程，容易受到环境因素、生物因素、药物接触、感染、吸烟等作用导致染色质结构异常，高度浓缩的结构造成精子缺乏修复DNA缺陷的能力，结构损伤比较稳定，可一直存在。染色质结构异常的发生机制假说包括染色质包装缺陷、凋亡异常及氧化应激等，表现为核蛋白组型异常和DNA链碎片化。核蛋白核型异常的精子由于核蛋白对DNA的保护作用减低，更容易出现DNA链断裂。而这种损伤较难由传统的如精子密度、精子活力、活率等指标来反映，这种由DNA损伤导致的男性不育在原发性不育患者中占有较大比例，因此进行精子DNA完整性检测对于诊断男性不育患者的病因及采取相应治疗措施非常必要。
[0005]随着年龄增长，DNA碎片阳性率呈增高趋势，也使得辅助生殖技术的成功率大大降低，当阳性率大于30％时一般认为宫腔内人工授精、IVF和单精子卵细胞质内注射治疗没有怀孕几率或妊娠率很低。而该项检测与精液常规中的精子前向运动百分率降低相吻合，这也解释了DNA损伤导致受孕率降低的机制。
[0006]现有技术的精子DNA碎片检测方法目前有精子染色质结构分析、彗星实验、末端转移酶介导的dUTP末端标记法及精子染色质扩散法(SCD)。现有技术基本采用基于流式细胞技术的精子染色质结构分析、精子染色质扩散法。基于流式细胞技术的精子染色质结构分析需要昂贵的流式细胞仪配套使用，使用成本高；且流式细胞仪的操作复杂，需要较高专业水平，因此该法不便于大规模普及应用。精子染色质扩散法通过人工处理涂片并在显微镜下计数的办法实施，该方法不需要昂贵的设备，普通试验室即可开展；但是没有配置完整规范化试剂盒，配方缺陷导致测试结果一致性较差。
[0007]因此，提供一种精子核DNA完整性检测试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
[0008]有鉴于此，本专利技术提供了一种精子核DNA完整性检测试剂盒，引入反应体系完整的规范化试剂盒，既有性能良好的洗涤液又有具有保存能力的SCD保存液，测试结果一致性更好。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]一种精子核DNA完整性检测试剂盒，包括：裂解液、变性液、SCD浓缩洗涤液(20X)、低熔点琼脂糖管、预处理载玻片、染色剂A液、染色剂B液、SCD保存液；
[0011]所述裂解液为含1.0％～2.0％(w/v)EDTA二钠、3％～7％(w/v)Tris base、3％～6％(w/v)氯化钠、3％～8％(v/v)吐温
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20、1％～3％(w/v)二硫苏糖醇的水溶液；
[0012]所述变性液为含0.3％～0.5％(w/v)盐酸的水溶液。
[0013]所述SCD浓缩洗涤液(20X)为含0.01％～0.08％(w/v)EDTA二钠、0.5％～2.5％(w/v)Tris base、1％～5％(w/v)硼酸的水溶液；使用时20倍纯化水稀释。
[0014]所述低熔点琼脂糖管为装有1％～4％(w/v)的低熔点琼脂糖(融胶温度≤65℃)水溶液的离心管；使用时直接在75～85℃热水中溶解后，移至37℃下保温，并将待测精液样本适量混合，在均匀涂覆在预处理载玻片上。1％～4％(w/v)的低熔点琼脂糖水溶液作为精子定位溶液使用。低熔点琼脂糖溶液在室温及以下温度时，处于凝胶状态；为了操作者使用方便，制造试剂盒时，将在80～90℃下溶解好的低熔点琼脂糖溶液按使用需要的体积比如140μL分装，置于0.5～1mL的小容器(比如0.5mL或1mL普通离心管)中，离心管无特殊要求。
[0015]所述预处理载玻片为包被有0.3％～1.3％(w/v)的琼脂糖(融胶温度≤80℃)水溶液的载玻片；所述预处理载玻片的制备方法如下：将0.3％～1.3％(w/v)的琼脂糖水溶液在80～90℃下溶解成均匀的溶液，将(用一小段毛玻璃面做标记的)载玻片完全浸入溶解均匀的溶液3～5秒取出，擦去背面琼脂糖溶液，另一面在室温下晾干(将不需要试验的一面的琼脂糖溶液擦干，另一面在室温下晾干即可)。
[0016]所述染色剂A液0.1％(w/v)瑞氏色素、0.1％(w/v)姬姆氏色素的甲醇溶液；
[0017]所述染色剂B液为0.03％(w/v)磷酸二氢钾、0.05％(w/v)磷酸氢二钠的水溶液，pH 6.8。
[0018]所述SCD保存液为含5％～10％(w/v)蔗糖、1％～3％(w/v)柠檬酸钠、3％～8％(w/v)二甲基亚砜的水溶液；作为精液保存液，使用时与精液混匀后
‑
20℃冷冻保存，能保证15天解冻测试不影响测试效果。
[0019]进一步，将上述精子核DNA完整性检测试剂，按下述体积分装成试剂盒：
[0020][0021][0022]进一步，一种精子核DNA完整性检测试剂盒的检测方法，具体步骤如下：
[0023]1)试剂准备
[0024](1)将低熔点琼脂糖管置于80℃孵育20分钟，待完全融化后，将低熔点琼脂糖管置于37℃待用(从80℃转移至37℃需要至少平衡5min后方可使用)。
[0025](2)自行配制不同浓度的乙醇溶液：取一定量的蒸馏水和无水乙醇分别配制浓度70％、90％的乙醇溶液。
[0026](3)根据检测样本的多少取适量SCD浓缩洗涤液(20X)，用纯化水按1：19稀释成洗涤液待用。
[0027](4)检测前将室温调整至20～28℃范围内。
[0028]2)标本准备
[0029](1)以生理盐水调整液化的新鲜精子(或液氮冻存的精子或经提取后的活动精子)浓度至(5
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10)
×
106/mL。
[0030](2)不能完成检测的新鲜标本，需要加入3倍体积的SCD保存液后再冷冻保存(可至少保存15天)。
[0031]方法如下：在离心管中加入SCD保存液300μL和待保存精液100μL，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种精子核DNA完整性检测试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、变性液、20X SCD浓缩洗涤液、低熔点琼脂糖管、预处理载玻片、染色剂A液、染色剂B液、SCD保存液；所述裂解液为含1.0％～2.0％EDTA二钠、3％～7％Tris base、3％～6％氯化钠、3％～8％吐温
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20、1％～3％二硫苏糖醇的水溶液；所述变性液为含0.3％～0.5％盐酸的水溶液。所述20X SCD浓缩洗涤液为含0.01％～0.08％EDTA二钠、0.5％～2.5％Tris base、1％～5％硼酸的水溶液；所述低熔点琼脂糖管为装有1％～4％的低熔点琼脂糖水溶液的离心管；所述预处理载玻片为包被有0.3％～1.3％的琼脂糖水溶液的载玻片；所述染色剂A液为0.1％瑞氏色素、0.1％姬姆氏色素的甲醇溶液；所述染色剂B液为0.03％磷酸二氢钾、0.05％磷酸氢二钠的水溶液，pH6.8；所述SCD保存液为含5％～10％蔗糖、1％～3％柠檬酸钠、3％～8％二甲基亚砜的水溶液。2.根据权利要求1所述的一种精子核DNA完整性检测试剂盒，其特征在于，按下述体积分装成试剂盒：3.根据权利要求1或2所述的一种精子核DNA完整性检测试剂盒的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：1)试剂准备(1)将低熔点琼脂糖管置于80℃孵育，待完全融化后，将低熔点琼脂糖管置于37℃待用；至少平衡5min；(2)自行配制浓度70％、90％的乙醇溶液；(3)将20X SCD浓缩洗涤液稀释20倍，制成洗涤液，待用；(4)检测前将室温调整至20～28℃范围内；2)标本准备(1)以生理盐水调整液化的新鲜精子或液氮冻存的精子或经提取后的活动精子浓度至5
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10
×
106/mL；(2)不能完成检测的新鲜标本，需要加入3倍体积的SCD保存液后再冷冻保存；3)检测方法
(1)取精子...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁有安，韩芝斌，欧阳春裕，许墨横，黎燕，
申请(专利权)人：深圳市盛信康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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