一种杜仲含胶细胞原位观测方法技术

本发明专利技术公开了一种杜仲含胶细胞原位观测的方法。该方法包括：新鲜杜仲叶、皮、籽壳经预处理、变性处理、透明处理和封片处理，将封片后的不同组织用于杜仲含胶细胞原位观测。所述预处理包括：新鲜杜仲组织清洗处理，在FAA中的脱气、固定处理。本发明专利技术通过对新鲜的杜仲叶、皮、籽壳进行预处理，改善其工艺条件，使得杜仲胶细胞可以不使用石蜡切片或冷冻切片进行原位观察，有效提高杜仲含胶细胞的观测效率，解决切片过程中含胶细胞常破碎不完整的问题，为杜仲含胶细胞的生长发育研究提供新的技术手段。仲含胶细胞的生长发育研究提供新的技术手段。仲含胶细胞的生长发育研究提供新的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种杜仲含胶细胞原位观测方法


[0001]本专利技术属于天然橡胶含胶细胞生物合成领域，更具体的说是，一种杜仲含胶细胞的观测方法。

技术介绍

[0002] 杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是中国特有的单科单属单种的活化石植物，也是世界上分布范围最广的胶源植物。杜仲树叶（2%~3%）、皮（8%~10%）、种皮（15%~18%）中均含有丰富的白色丝状物—杜仲胶。作为一种天然高分子材料，杜仲胶（反式—聚异戊二烯）与普通的天然橡胶（顺式—聚异戊二烯）构成同分异构体，可作为潜在的橡胶资源。杜仲胶大分子结构本身具有三大特点：柔性链、反式结构、含双键。杜仲胶的产量是其工业应用可持续发展的物质基础，但杜仲不同器官的生长周期不同，导致其形成积累杜仲胶的含量、聚合度和分子量有着显著的差异，加之提取方法的不足，严重限制了杜仲胶的规模化应用，高品质原本杜仲胶的提取分离技术在其应用产业链中始终处于核心地位。要高效提取分离杜仲胶需要对其细胞壁的形成积累的过程进行系统研究。因此，明确杜仲含胶细胞形成积累过程中细胞壁结构和组分变化规律以及原本杜仲胶定向高效解离是该领域持续研究的难点。
[0003]杜仲含胶细胞是杜仲植株体内合成和储藏杜仲橡胶的场所，主要分布在植株各个器官的初生和次生韧皮部中。杜仲植株体中含胶细胞的多少及其大小直接影响其含胶量的高低。杜仲含胶细胞的发生、发育和初生结构的分化同时进行，在含胶细胞生长发育过程中，细胞内逐渐合成和积累橡胶颗粒，随着橡胶颗粒的增加，其细胞器逐渐退化、消失，最终除了橡胶颗粒外仅剩下内质网、质体、线粒体及纤维素的细胞壁。杜仲含胶细胞内的硬性橡胶颗粒在积累上是一个由少到多、由小到大、由不均匀分布到均匀分布的过程。
[0004]对于杜仲含胶细胞的显微观测技术，目前相关文献报道较少，一般采用的是常规石蜡切片和冷冻切片，常规石蜡切片采用FAA固定24h以上，溴碘冰醋酸处理48h以上后用乙醇和二甲苯系列脱水透明，浸蜡，包埋，切片后脱蜡，染色，封片观察；冷冻切片采用冷冻包埋剂包埋后冷冻切片，染色后使用甘油明胶封片剂封片观察。若要观察到完整的杜仲含胶细胞，一般采用氢氧化纳溶液处理后结合果胶酶处理，提取出完整的杜仲含胶细胞。这三种方法主要存在以下不足：
[0005] （1）石蜡切片所需周期一般在14天以上，时间较长。而冷冻切片在对硬的组织例如树皮和籽壳，很难切片，并且在染色过程中易脱片，进而影响杜仲胶细胞观测。
[0006] （2）杜仲胶细胞长度为900~3000μm，且在籽壳树叶中一般不成直线分布，因此使用传统的石蜡切片和冷冻切片很难观察到完整的杜仲含胶细胞。
[0007] （3）而提取杜仲含胶细胞的方法虽然能观察到完整的杜仲含胶细胞，但不能明确杜仲含胶细胞的分布规律，还需结合切片技术进行辅助解析。
[0008]目前所使用的杜仲含胶细胞观测方法存在着周期长，步骤复杂，有观测限制等一系列不足。

技术实现思路

[0009]为了解决现有技术无法实现杜仲含胶细胞原位观测的问题。本专利技术提供了一种杜仲含胶细胞原位观测的方法。着重解决杜仲叶、皮和籽壳中的杜仲胶分布不清晰和不同位置杜仲胶长度直径难以测量的问题。本专利技术通过对新鲜杜仲原材料的脱木素和透明化处理，改善其工艺条件，缩短了杜仲胶细胞观测的工艺时长，有效解决了杜仲含胶细胞在实验过程中难以原位观察和测量的问题，提高了观察效率。
[0010]本专利技术的目的之一是提供一种杜仲含胶细胞原位观测的方法。
[0011]包括：杜仲原材料经预处理、固定处理、变性处理、脱木素和透明处理、封片处理，实现杜仲含胶细胞原位观测。
[0012]其中，
[0013]所述杜仲原材料包括新鲜杜仲叶、新鲜杜仲皮和新鲜杜仲籽壳。
[0014]所述预处理包括新鲜杜仲叶、皮和籽壳需要使用超纯水清洗干净，擦干后立即置于FAA固定液中。
[0015]所述固定处理时需要置于FAA溶液中完全没过并在
‑
0.08MPa下保持30分钟，随后密封于阴凉处静置24h。
[0016] 所述变性处理包括：经所述预处理，所述固定处理的杜仲叶、皮和籽壳经1M PBS缓冲液冲洗后加入到变性试剂中，密封避光保存48h。
[0017] 所述变形试剂为溴碘冰醋酸溶液，其中饱和溴水45 ml，单质碘2.5 g，之后加入冰醋酸至100 ml，搅拌均匀后的溶液。
[0018]杜仲原材料的体积为固定试剂和变性试剂体积的二十分之一到三十分之一。
[0019]所述脱木素和透明处理包括： 将变性处理后的杜仲叶、皮和籽壳过滤，取完整的组织，使用1M PBS缓冲液冲洗干净，置于氢氧化钠、亚硫酸钠溶液中，密封后置于60℃烘箱中保存24~48h。
[0020] 1M PBS缓冲液冲洗的流速为1米/秒~2米/秒； 氢氧化钠、亚硫酸钠溶液质量浓度为5%~10%的混合溶液。
[0021]杜仲叶、皮和籽壳应根据材料种类和厚度来调整烘箱中的保存时间，一般杜仲叶保存24h，杜仲皮和籽壳保存48h，若材料不够透明应适当延长时间。
[0022] 将经过所述脱木素和透明处理后的杜仲组织，轻轻移至载玻片上，使用1M PBS缓冲液冲洗至pH为中性。
[0023] 1M PBS缓冲液冲洗的流速为1米/秒~2米/秒。
[0024]所述封片处理需要使用甘油明胶封片剂对杜仲组织进行封片。
[0025]所述甘油明胶封片剂必须在组织未脱水时滴加，滴加量为2~4滴，视组织大小而定。
[0026]本申请方法中的固定处理是为了保证组织不过度收缩或膨胀，进行抽气处理是为了去除细胞内的空气，加速固定液进入，因为变性试剂、脱木素和透明试剂是高浓度的溶剂，所以新鲜的杜仲树叶，树皮和籽壳不固定的话易发生收缩。
[0027]选择60℃的透明脱木素温度主要是考虑杜仲组织中的杜仲胶的结晶温度为65℃，在这个温度下处理不会影响杜仲胶的结晶，而温度相对较高可以加快脱木素和透明处理的
速度。使用氢氧化钠、亚硫酸钠混合溶液则可以同时实现组织脱木素和透明。
[0028] 在两次冲洗过程中选择1M PBS缓冲液是因为该缓冲液接近细胞内的渗透压，可以较好的保持组织的形态不会发生太大的变化。
[0029]本专利技术具体可以采用以下技术方案：
[0030] （1）新鲜杜仲叶、皮和籽壳预处理：取适量的新鲜杜仲叶、皮和籽壳，使用超纯水清洗干净，擦干后备用，应注意，选取组织的大小应小于载玻片的大小，如果大于载玻片大小，应适当裁剪。
[0031] （2）固定处理：固定处理是指将预处理后的杜仲叶、皮和籽壳立即置于FAA溶液中完全没过并在
‑
0.08MPa下保持30分钟，进而去除组织中的空气，随后密封于阴凉处静置24h，组织的量应为FAA溶液体积的二十分之一到三十分之一。
[0032] （3）变性处理：变性处理是指将干燥后的叶片通过与强氧化性试剂反应，进而除去叶片中存在的叶绿素，部分无机盐离子等，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杜仲含胶细胞原位观测的方法，其特征在于所述方法包括：新鲜的杜仲叶、皮和籽壳经预处理、固定处理、变性处理、脱木素和透明处理、封片处理，使杜仲含胶细胞可以不经切片直接观测；所述预处理包括：新鲜杜仲叶、皮和籽壳需要使用超纯水清洗干净，擦干后立即置于FAA固定液中，使用超纯水清洗干净，擦干后立即置于FAA固定液中；所述固定处理包括：置于FAA溶液中完全没过并在
‑
0.08MPa下保持30分钟，随后密封于阴凉处静置24h；所述变性处理包括：经预处理，固定处理的杜仲叶、皮和籽壳经1M PBS缓冲液冲洗后加入到变性试剂中，密封避光保存48h；所述脱木素和透明处理包括：变性处理后的杜仲叶、皮和籽壳使用1M PBS缓冲液冲洗，置于质量浓度为10%的氢氧化钠、亚硫酸钠溶液中，密封后置于60℃烘箱中保存24~48h，杜仲叶、皮和籽壳应根据材料种类和厚度来调整烘箱中的保存时间，一般杜仲叶保存24h，杜仲皮和籽壳保存48h，若材料不够透明应适当延长时间；所选取的材料面积应小于载玻片的面积，所选取的部位厚度应不超过2mm；1M PBS缓冲液冲洗流速为1.5米/秒~2米/秒；所述封片处理包括：使用甘油明胶封片剂完全包裹载玻片上的样品，并排出气泡；所使用的甘油明胶封片剂使用前须在37~40℃温育，并在完全溶解后使用。2.根据权利要求1所述的杜仲含胶细胞原位观测的方法，其特征在于：所述的方法具体为：（1）所述预处理包括：所述杜仲原材料包括新鲜杜仲叶、新鲜杜仲皮和新鲜杜仲籽壳；（2）所述固定处理包括：所述预处理包括新鲜杜仲叶、皮和籽壳需要使用超纯水清洗干净，擦干后立即置于FAA固定液中；（3）所述变性处理包括：经所述预处理，所述固定处理的杜仲叶、皮和籽壳经1M PBS缓冲液冲洗后加入到变性试剂中，密封避光保存48h；（4）所述脱木素和透明处理包括：将变性处理后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱铭强，马学峰，杨鑫，姚雪峰，兰彩宁，迟志振，龙大平，勒晓娜，邱凌，杨选民，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：