货物分子转导结构域RMAD1、其的变体、重组货物分子以及利用其的货物分子转导方法技术

本发明专利技术涉及一种来源于人类ADARB2的细胞穿膜肽以及利用其的货物分子运输系统，提供一种包括来源于人类ADARB2的RMAD1或者其的变体的货物分子转导结构域、以及包括使与所述货物分子转导结构域融合的重组货物分子与细胞进行接触的步骤的向细胞内运输货物分子的方法。本发明专利技术的货物分子转导结构域相比现有的细胞穿膜肽，不仅能够以高效率向细胞内导入货物分子，而且作为来源于人类蛋白质的多肽序列，无需担心引起免疫反应的问题，因此，有效利用于在向人体细胞内运输各种高分子物质中。在向人体细胞内运输各种高分子物质中。在向人体细胞内运输各种高分子物质中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】货物分子转导结构域RMAD1、其的变体、重组货物分子以及利用其的货物分子转导方法


[0001]本专利技术涉及来源于人类ADARB2的货物分子转导结构域RMAD1、其的变体、将其加密的基因构建体、载体、重组货物分子以及利用其的货物分子转导方法，提供包括来源于人类ADARB2的RMAD1或者其的变体的货物分子转导结构域、以及包括使融合所述货物分子转导结构域和货物分子的重组货物分子与细胞接触的步骤的向细胞内运输货物分子的方法。

技术介绍

[0002]蛋白质运输技术被称作蛋白质转导结构域(Protein Transduction Domain；PTD)或者细胞穿膜肽(Cell penetrating Peptide；CPP)，是将大致由5至30个氨基酸组成的肽与蛋白质或者基因等的高分子进行融合后，能够容易运输至哺乳类细胞、组织、血液等生物体内的新概念的运输系统。
[0003]虽然尚未明确具体机制，但是，蛋白质运输技术多使用在将治疗用蛋白运输至体外和体内、细胞或者组织内，周知有各种蛋白质转导结构域。除了共价键之外，还可以通过离子键、静电键等的各种方法来完成蛋白质转导结构域和生物货物分子(例如，核酸、蛋白质、肽、小分子、细胞毒性药物等)之间的结合。
[0004]蛋白质转导结构域相比脂质体或者聚合物等其他运输体，具有毒性低且排异反应小的优点。然而，目前为止，使用在临床等上的蛋白质转导结构域还是很少。
[0005]双链RNA特异性腺苷脱氨酶B2(RNA
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editing deaminase<br/>‑
2；简称“RED2”或者“ADARB2”)是在人类中通过ADARB2基因而被加密的酶。该酶编辑活性不足，而且防止其他ADAR酶与试管内靶向发生结合，降低该酶的有效性。ADARB2蛋白质不仅与dsRNA发生结合，还能与ssRNA发生结合。ADARB2是RNA编辑酶的双链RNA(dsRNA)腺苷脱氨酶家族的成员。Pre
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mRNA的腺苷脱氨基作用导致基因产物的氨基酸序列发生变化，这与通过基因组DNA序列预测的不同。
[0006]然而，目前为止尚未有报告指出ADARB2蛋白质的一部分序列有可能可以用作货物分子转导结构域。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于，提供一种使货物分子高效率地渗透至细胞或者组织内，并在用于人体时，没有副作用或者副作用少的货物分子转导结构域、与该货物分子转导结构域融合的重组货物分子、以及利用该货物分子转导结构域使货物分子渗透至细胞或者组织内的方法。
[0008]为了解决所述问题，选择许多来源于人类的候选肽进行试验的结果，本专利技术人确认到来源于人类ADARB2蛋白质的CKSKRRRRRRSKRKD的由15个氨基酸组成的肽(以下，本专利技术中称为“RMAD1”)或者其中一部分氨基酸发生缺失、取代以及/或者添加的肽能够使蛋白质、核酸等的高分子顺利渗透至细胞、组织、血液等的生物体内，而且所述RMAD1或者其的变体
肽相比HIV
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Tat肽，细胞以及组织渗透能力显著优异。
[0009]本专利技术人为了利用来源于人类ADARB2蛋白质的细胞穿膜肽RMAD1来验证自身渗透功效，合成FITC进行了FACS实验，其结果，确认到RMAD1肽相比HIV
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Tat肽非常容易渗透至细胞内。
[0010]另外，本专利技术人为了评价RMAD1肽是否与货物分子结合而容易渗透至细胞内并向细胞内运输货物分子，作为试验用货物分子，粘贴EGFP(增强型绿色荧光蛋白；Enhanced Green Fluorescence Protein)蛋白进行了实验。通过EGFP和RMAD1的融合蛋白载体设计以及提纯，制备纯度高的融合蛋白，利用该蛋白通过免疫印迹、FACS、共聚焦显微镜之类的各种验证方法，确认到EGFP
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RMAD1融合蛋白相比HIV
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Tat肽，向细胞内运输货物分子的能力优异。
[0011]专利技术效果
[0012]通过本专利技术新发掘的货物分子转导结构域，其细胞渗透能力优异，有效用作货物分子转导物质，而且是来源于人体的物质，因此当施用于人体时，没有引起免疫反应的危险而安全。
[0013]另外，本专利技术的货物分子转导结构域相比现有的其他货物分子转导结构域，细胞渗透能力显著优异，从而，可以使蛋白质药物、抗原表位等难以渗透细胞的各种物质顺利渗透，由此可以应用到药物、化妆品等中。
附图说明
[0014]图1是示出RMAD1细胞穿膜肽的2级结构预测图。A是利用Pep
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fold3程序预测的肽的2级结构。B是示出肽的Pepfold的图表。
[0015]图2的A、B是利用3T3、B16F10的两种细胞系处理缀合有2.5uM的FITC的RMAD1以及缀合有2.5uM的FITC的TAT之后，测量渗透至细胞内的FITC RMAD1的量(荧光值)的结果。C是将RMAD1以及其变体各自与FITC缀合之后，以2.5uM进行处理，然后测量渗透至细胞内的FITC RMAD1以及变体的量(荧光值)的结果。除了未处理对照组之外，作为对照组使用了利用2.5uM的FITC TAT进行处理的组。
[0016]图3a至图3d示出融合有EGFP的RMAD1的载体图以及提纯的蛋白质的纯度。图3a示出EGFP
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RMAD1使用何种限制酶，向pET28a载体进行亚克隆(sub
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cloning)。图3b是通过考马斯亮蓝(Coomassie blue)确认提纯的EGFP
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RMAD1的分子量的结果。图3c是能够确认提纯的EGFP
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RMAD1的分子量以及顺利提纯的免疫印迹结果。图3d是向HaCaT细胞处理提纯的EGFP
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RMAD1、EGFP、EGFP
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TAT之后，将EGFP的运输率利用免疫印迹与EGFP、EGFP
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TAT进行比较，由此确认的结果。
[0017]图4a至图4d是利用FACS确认细胞渗透性的结果。图4a是向HaCaT细胞分别处理2.5uM的EGFP
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RMAD1、EGFP、EGFP
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TAT之后，通过FACS确认运输至细胞的EGFP的量的结果。图4b是利用直方图示出图4a中示出的荧光数值的结果。图4c是按照各个量处理2小时之后，利用FACS确认EGFP
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RMAD1、EGFP、EGFP
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TAT的细胞渗透性的结果。图4d是按照各个时间处理2.5uM之后，利用FACS确认EGFP
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RMAD1、EGFP、EGFP
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TAT的细胞渗透性的结果。
[0018]图5a是向HaCaT细胞分别处理2.5uM的EGFP
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RMAD1、EGFP、EGFP
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TAT之后，将运输至细胞的EGFP的图像通过共聚焦显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种货物分子转导结构域，其中，作为1)来源于人类ADARM2的由SEQ ID NO：1组成的RMAD1肽；或者2)在RMAD1肽中一个以上的氨基酸发生缺失、取代以及/或者添加的、由8至50个氨基酸组成的RMAD1变体肽，所述货物分子转导结构域与货物分子发生结合，从而向哺乳类的细胞内或者组织内转导货物分子。2.根据权利要求1所述的货物分子转导结构域，其中，在RMAD1变体肽中，氨基酸取代为保守氨基酸取代。3.根据权利要求1或2所述的货物分子转导结构域，其中，RMAD1变体肽是SEQ ID NO：1的赖氨酸残基位置独立地被精氨酸残基取代以及/或者SEQ ID NO：1的精氨酸残基位置独立地被赖氨酸残基取代的序列。4.根据权利要求1所述的货物分子转导结构域，其中，在RMAD1变体肽中，1个以上的氨基酸发生缺失的肽序列是在RMAD1肽的氨基酸中，赖氨酸残基以及精氨酸残基中的1个至6个发生缺失。5.根据权利要求1所述的货物分子转导结构域，其中，在RMAD1变体肽中，1个以上的氨基酸发生缺失的肽序列以及/或者添加1个以上的氨基酸的肽序列是在N端以及C端中的一个以上发生氨基酸缺失以及/或者添加。6.根据权利要求1至5中任一项所述的货物分子转导结构域，其中，1)来源于人类ADARB2的由SEQ ID NO：1组成的RMAD1肽；或者2)在RMAD1肽中一个以上的氨基酸发生缺失、取代以及/或者添加的、由8至50个氨基酸组成的RMAD1变体肽；中的一个以上在没有连接体的情况下，或者通过连接体被结合为二聚体以上的多聚体形态。7.一种细胞膜渗透率提升的重组货...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴赞浩，赵诚敏，
申请(专利权)人：株式会社莱美迪，
类型：发明
国别省市：