本发明专利技术公开了一种游动细胞机器人及其制备方法，它涉及微纳米机器人技术领域。本发明专利技术要构建同时具有能穿透生物屏障的细胞机器人和能实现肿瘤微环境中自驱动的纳米机器人功能的游动细胞机器人。方法为：获取中性粒细胞；采用脱溶法联合共挤出法制备大肠杆菌外膜伪装的载药纳米凝胶颗粒；然后对载药纳米凝胶颗粒进行双酶修饰得到载药双酶驱动纳米机器人；将步骤一获得的中性粒细胞与步骤三的载药双酶驱动纳米机器人共孵育，诱导中性粒细胞吞噬载药双酶驱动纳米机器人，得到游动细胞机器人。本发明专利技术可以在细胞因子、炎症因子、趋化肽等物质刺激下进行定向的趋化运动，具有良好的生物相容性，能够跨越血脑屏障，能避免免疫清除，在体内较好存活，具有较好的生物医学应用前景，本发明专利技术应用于医学领域。本发明专利技术应用于医学领域。本发明专利技术应用于医学领域。
【技术实现步骤摘要】
一种游动细胞机器人及其制备方法
[0001]本专利技术属于微纳米机器人
，具体涉及一种游动细胞机器人的制备方法。
技术介绍
[0002]中性粒细胞是体内最丰富的白细胞，是固有免疫的一部分，在固有免疫响应过程中最先被招募，起到消灭病原体、吞噬异物等功能。将来源于生物体的中性粒细胞与可在肿瘤微环境中进行自驱动的纳米机器人相结合，构建生物相容性好，不易被免疫清除的细胞杂化二级马达，能够在体内靶向药物递送、跨越特殊生物屏障、在肿瘤微环境中自驱动、对肿瘤组织进行深入渗透等体内治疗场景中得到丰富的应用。但是目前多采用合成材料制备得到可自驱动的纳米机器人，或者将简单的纳米颗粒与细胞相结合制备细胞杂化马达等，并没有采用中性粒细胞与具有自驱动能力的纳米机器人结合的报道。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是为了构建同时具有能穿透生物屏障的细胞机器人和能实现肿瘤微环境中自驱动的纳米机器人功能的游动细胞机器人。而提供一种游动细胞机器人的制备方法。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术采取了以下的技术方案：
[0005]本专利技术的目的在于提供一种游动细胞机器人的制备方法，所述制备方法是按照以下步骤进行的：
[0006]步骤一、采用脱溶法联合共挤出法制备大肠杆菌外膜伪装的载药纳米凝胶颗粒；
[0007]步骤二、对步骤一的载药纳米凝胶颗粒进行双酶修饰，得到载药双酶驱动纳米机器人；
[0008]步骤三、将中性粒细胞与步骤二的载药双酶驱动纳米机器人共培养，诱导中性粒细胞吞噬纳米颗粒，制备得到游动细胞机器人；
[0009]其中，双酶为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。
[0010]进一步地限定，步骤一中所述的载药纳米凝胶颗粒具体制备方法如下：
[0011]1)将1.25g明胶粉加入25ml水中，加热至50℃，直至完全溶解，冷却至室温，然后以450rpm速率搅拌，再加入25mL丙酮，加入丙酮3分钟后丢弃含有低分子量明胶馏分的上清液；
[0012]2)将步骤1)剩余的沉淀加入25ml水中，再次加热至50℃，直至完全溶解；
[0013]3)用1n HCl调节该溶液的pH至3.0，在600rpm,40℃的持续搅拌下，使用注射泵以2.75ml min
‑1的速度加入75ml丙酮，丙酮加入完成后，立即以0.05mL
.
min
‑1的速度向明胶溶液中加入0.2mL质量浓度为50％戊二醛溶液，交联纳米凝胶，搅拌1h，室温孵育过夜；
[0014]4)然后使用旋转蒸发器在25℃缓慢蒸发丙酮至终体积10毫升，剩下的溶液通过0.2μm的注射器过滤器过滤，得到纳米凝胶颗粒；
[0015]5)将得到的纳米凝胶颗粒浸泡在Dox溶液中4小时，以使纳米凝胶颗粒吸附Dox至
饱和；
[0016]6)将大肠杆菌，5000rpm离心10min去除菌体，过0.45微米滤膜，使用超滤离心管浓缩上清液，在4℃条件下150000rpm离心2h，得到大肠杆菌外膜囊泡；
[0017]7)使用共挤出法，将步骤6)得到的大肠杆菌外膜囊泡通过200nm滤膜挤压11次，获得细菌膜囊泡；
[0018]8)将步骤7)得到的细菌膜囊泡与步骤4)得到的纳米凝胶颗粒混合，通过200nm滤膜挤压21次，离心清洗3次，得载药纳米凝胶颗粒。
[0019]进一步地限定，步骤6)中，超滤离心管的截留分子量为100k Da。
[0020]进一步地限定，步骤二中所述的载药双酶驱动纳米机器人具体制备方法如下：
[0021]步骤1)步骤一得到的载药纳米凝胶颗粒溶液滴加到亲水盖玻片上，铺开单层，进行单侧喷金；
[0022]步骤2)将3
‑
巯基丙酸乙醇溶液滴加其中，震荡2小时后，离心弃去上清液；
[0023]步骤3)向被3
‑
巯基丙酸修饰的喷金后的载药纳米凝胶颗粒中滴加1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的PBS(p H 5.5)水溶液，震荡6小时后，离心弃去上清液；
[0024]步骤4)将上述纳米颗粒分散到1.5mg/mL葡萄糖氧化酶(GOx)和过氧化氢酶(CAT)的PBS(p H 5.5)水溶液中，震荡12小时后，离心弃去上清液，即得到载药双酶驱动纳米机器人，将其置于4℃冰箱中贮存。
[0025]进一步地限定，所述的离心清洗转速均为9000rpm。
[0026]进一步地限定，步骤2)中，3
‑
巯基丙酸乙醇溶液的浓度为2mM。
[0027]进一步地限定，步骤3)中，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的PBS(p H 5.5)水溶液的浓度为2mM。
[0028]进一步地限定，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的PBS(p H 5.5)水溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为1.5mg/mL，过氧化氢酶的浓度为1.5mg/mL。
[0029]进一步地限定，步骤三中所述的将步骤一获得的中性粒细胞与步骤三的载药双酶驱动纳米机器人共培养，是通过如下方式进行的：
[0030]将中性粒细胞用PBS稀释，然后离心去除分离中性粒细胞的所用的Percoll分离液；然后将步骤二的载药双酶驱动纳米机器人分散到去除Percoll分离液的中性粒细胞悬液中，在37℃水浴条件下共培养30min后，离心清洗，即完成所述的共培养。
[0031]进一步地限定，步骤一中所述的获取中性粒细胞是从新鲜分离的小鼠骨髓中分离获取的；所述的中性粒细胞是通过如下方式获取：
[0032]1)将小鼠后肢股骨、胫骨或前肢肱骨，剪断两端，以RPMI1640培养基冲洗骨内腔多次，直至骨呈白色半透明，收集RPMI1640培养基冲洗液，离心后，收取固相物并重悬于磷酸盐缓冲液中，得细胞悬液；
[0033]2)依次将体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离液加入离心管中，形成界面；所述的体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离液是通过体积百分含量为100％Percoll分离液与生理盐水配制而成；
[0034]3)向步骤2)中体积百分含量为61％Percoll分离液表面加入步骤1)的细胞悬液，离心后，吸取位于体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离
液界面液体，即得到中性粒细胞。
[0035]进一步地限定，步骤1)中所述的离心是在1600rpm离心5min。
[0036]进一步地限定，步骤3)中所述的离心是在3000rpm离心30min。
[0037]进一步地限定，所述的体积百分含量为100％Percoll分离液是采用Percoll原液与浓度为1.5M NaCl溶液按体积比为9:1的比例混合而成。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种游动细胞机器人的制备方法，其特征在于，所述制备方法是按照以下步骤进行的：步骤一、采用脱溶法联合共挤出法制备大肠杆菌外膜伪装的载药纳米凝胶颗粒；步骤二、对步骤一的载药纳米凝胶颗粒进行双酶修饰，得到载药双酶驱动纳米机器人；步骤三、将中性粒细胞与步骤二的载药双酶驱动纳米机器人共培养，诱导中性粒细胞吞噬纳米颗粒，制备得到游动细胞机器人；其中，双酶为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。2.根据权利要求1所述的一种游动细胞机器人的制备方法，其特征在于，步骤一中所述的载药纳米凝胶颗粒具体制备方法如下：1)将1.25g明胶粉加入25ml水中，加热至50℃，直至完全溶解，冷却至室温，然后以450rpm速率搅拌，再加入25mL丙酮，加入丙酮3分钟后丢弃含有低分子量明胶馏分的上清液；2)将步骤1)剩余的沉淀加入25ml水中，再次加热至50℃，直至完全溶解；3)用1nHCl调节该溶液的pH至3.0，在600rpm,40℃的持续搅拌下，使用注射泵以2.75ml min
‑1的速度加入75ml丙酮，丙酮加入完成后，立即以0.05mL.min
‑1的速度向明胶溶液中加入0.2mL质量浓度为50％戊二醛溶液，交联纳米凝胶，搅拌1h，室温孵育过夜；4)然后使用旋转蒸发器在25℃缓慢蒸发丙酮至终体积10毫升，剩下的溶液通过0.2μm的注射器过滤器过滤，得到纳米凝胶颗粒；5)将得到的纳米凝胶颗粒浸泡在Dox溶液中4小时，以使纳米凝胶颗粒吸附Dox至饱和；6)将大肠杆菌，5000rpm离心10min去除菌体，过0.45微米滤膜，使用超滤离心管浓缩上清液，在4℃条件下150000rpm离心2h，得到大肠杆菌外膜囊泡；7)使用共挤出法，将步骤6)得到的大肠杆菌外膜囊泡通过200nm滤膜挤压11次，获得细菌膜囊泡；8)将步骤7)得到的细菌膜囊泡与步骤4)得到的纳米凝胶颗粒混合，通过200nm滤膜挤压21次，离心清洗3次，得载药纳米凝胶颗粒。3.根据权利要求7所述的一种游动细胞机器人的制备方法，其特征在于，步骤6)中，超滤离心管的截留分子量为100kDa。4.根据权利要求1所述的一种游动细胞机器人的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的载药双酶驱动纳米机器人具体制备方法如下：步骤1)...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺强，吴英杰，高圆圆，柯昌成，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：
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