一种利用雌激素相关受体调控家蚕表皮黑色素形成的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种利用雌激素相关受体调控家蚕表皮黑色素形成的方法。本发明专利技术一方面通过基于转基因技术的遗传改造手段来改变家蚕体内BmERR基因的表达，进而影响表皮斑纹的形成，其效率更高，周期更短，一般半年时间就可以获得斑纹稳定遗传的性状；另一方面，本发明专利技术适应性较高，可以通过调控任意家蚕品种体内BmERR基因的表达量来改变表皮斑纹，无品种限制。无品种限制。无品种限制。

【技术实现步骤摘要】
一种利用雌激素相关受体调控家蚕表皮黑色素形成的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种利用雌激素相关受体调控家蚕表皮黑色素形成的方法。

技术介绍

[0002]昆虫体色和斑纹的多样性有利于昆虫躲避敌害、体温调节、寻求伴侣、适应地理和抵抗紫外线等，是生物进化和自然选择的结果，具有重要的生物学意义。家蚕是鳞翅目昆虫的模式昆虫，具有较高的经济价值。家蚕品种众多，不同品种间家蚕体表的斑纹也不尽相同。有研究人员利用杂交选育等遗传操作培育出了斑纹限性品种家蚕(姚陆松,杜鑫,陈金娥等.斑纹全限性四元杂交多丝量家蚕新品种农科2号的选育[J].蚕业科学,2019,45(04):594
‑
597.DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2019.04.018.；龚大刚,鲜跃荣,冯光强.春秋兼用四元杂交斑纹全限性家蚕新品种锦
·
苑
×
绫
·
州的选育[J].蚕业科学,2017,43(06):1039
‑
1044.DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2017.06.021.；张友洪,肖金树,肖文福等.春秋兼用斑纹双限性家蚕品种蜀63
×
限16的育成[J].蚕业科学,2015,41(06):1017
‑
1022.DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2015.06.007.)；斑纹限性品种家蚕在幼虫期可以依靠其体表斑纹的不同区分雌雄，实现雌雄蚕分养或专养雄蚕，从而具有降低蚕种生产成本、提高蚕种品质、增加蚕种繁育系数以及拓宽茧丝的应用范围等优势。
[0003]传统杂交育种是将斑纹限性品种与正常品种多次杂交，从而将限性斑纹的性状转移至正常品种中，从而获得新的斑纹限性品种。其也存在明显的不足：(1)周期长；选育一个新的斑纹品种需要两年左右的时间，耗费较高的人力物力；(2)具有品种限制性。目前全国各个蚕区具有不同的主流品种，例如“两广2号”在两广(广西、广东)蚕区覆盖面较广、推广数量最多；西南蚕区则主推“川山
×
蜀水”家蚕品种。杂交选育难以在这些主流品种上进行遗传改良。
[0004]家蚕斑纹的形成主要由基因控制。黑色素代谢通路是影响家蚕体表斑纹生成的主要信号通路。例如，yellow
‑
y基因和酪氨酸羟化酶(tyrosine,TH)基因是控制ch突变体幼虫体色呈现巧克力色的主要原因；家蚕暗化型突变体(mln)体内由于AA
‑
NAT1基因出现了碱基缺失从而呈现黑化。这表明通过改变家蚕体内基因的表达来控制表皮斑纹的形成是具有一定的理论基础。
[0005]雌激素相关受体(estrogen
‑
related receptor，ERR)，是重要的核受体，其在昆虫的能量代谢和生长发育过程中发挥了重要的调控作用。无论是哺乳动物还是无脊椎动物中，此前从未报道过增加家蚕体内BmERR的表达，会导致表皮斑纹增加。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术一方面通过基于转基因技术的遗传改造手段来改变家蚕体内BmERR基因的表达，进而影响表皮斑纹的形成，其效率更高，周期更短(一般半年时间就可以获得斑纹稳定遗传的性状)；另一方面，本专利技术适应性较高，可以通过调控任意家蚕品种体
内BmERR基因的表达量来改变表皮斑纹，无品种限制。
[0007]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]本专利技术提供了家蚕BmERR基因在调控家蚕表皮黑色素形成中的应用。本专利技术通过调控家蚕体内BmERR基因的表达量来改变家蚕表皮黑色斑纹。家蚕BmERR基因CDS如SEQ ID NO:1所示。
[0009]本专利技术还提供了一种利用家蚕BmERR基因调控家蚕表皮黑色素形成的方法，包括以下步骤：
[0010]1、家蚕BmERR基因的克隆：
[0011]以五龄第三天家蚕品种dazao脂肪体的cDNA为模板进行PCR扩增，设计引物，上游引物为：5
’‑
ATGATGTCCGCAGTCAGTGG
‑3’
，下游引物为：5
’‑
TTACCGCAGACAGGCCTC GA
‑3’
，扩增条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存，获得SEQ ID NO:1所示序列(BmERR CDS序列)。
[0012]2、构建含家蚕BmERR基因的重组载体
[0013]A、家蚕BmERR基因CDS的TA克隆
[0014]将如SEQ ID NO:1所示序列的家蚕BmERR基因CDS与载体pMD
‑
19T simple进行TA克隆，得到重组载体pMD
‑
19T simple
‑
BmERR；
[0015]B、含有增强子
‑
全身性表达启动子
‑
家蚕BmERR基因CDS的重组载体的构建
[0016]设计同源重组引物，上游引物为：5
’‑
AGGATTGGTGGATCCATGATGTCCGCAGTCAGTG G
‑3’
,下游引物为：5
’‑
AGTTGTAGCGGCCGCTTACCGCAGACAGGCCTCGA
‑3’
，利用pMD
‑
19T simple
‑
BmERR为模板进行扩增，扩增条件与“家蚕BmERR基因克隆”中的扩增条件一致，回收扩增得到的BmERR基因CDS片段。用Not I和BamH I双酶切pSL1180[HR3
‑
A4
‑
DsRed
‑
SV40]质粒，回收pSL1180[HR3
‑
A4
‑
SV40]载体片段，将回收得到的BmERR基因CDS与pSL1180[HR3
‑
A4
‑
SV40]载体片段利用同源重组的方法进行连接，构成pSL1180[HR3
‑
A4
‑
BmERR
‑
SV40]重组质粒；
[0017]C、显微注射载体的制备
[0018]设计同源重组引物，上游引物为：5
’‑
TTATCGATACGCGTACGGCGCAGCGTCGTGAAAA GAGGCAATGAC
‑3’
，下游引物为：5
’‑
GAGATCGGCCGGCCTAGGCGTTCGTCAATGTATCAG TTTTGGTGC
‑3’
，以pSL1180[HR3
‑
A4
‑
BmERR
‑
SV40]重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.家蚕BmERR基因在调控家蚕表皮黑色素形成中的应用，其特征在于，通过调控家蚕体内BmERR基因的表达量来改变家蚕表皮黑色斑纹，家蚕BmERR基因CDS如SEQ ID NO:1所示。2.一种利用家蚕BmERR基因调控家蚕表皮黑色素形成的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：克隆家蚕BmERR基因；所述家蚕BmERR基因CDS如SEQ ID NO:1所示；S2：构建含家蚕BmERR基因的重组载体；S3：将重组载体质粒注射入家蚕胚胎中，孵化、饲养、交配、筛选获得表皮黑色斑纹改变的家蚕。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：采用上游引物和下游引物，以家蚕脂肪体的cDNA为模板进行PCR扩增，获得SEQ ID NO:1所示序列；上游引物为：5
’‑
ATGATGTCCGCAGTCAGTGG
‑3’
，下游引物为：5
’‑
TTACCGCAGACAGGCCTCGA
‑3’
。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2具体为：A、家蚕BmERR基因CDS的TA克隆采用TA克隆载体对如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmERR基因CDS进行TA克隆，得到TA克隆重组载体；B、含有增强子
‑
全身性表达启动子
‑
家蚕BmERR基因CDS的重组载体的构建采用同源重组引物，以步骤A得到的TA克隆重组载体为模板进行扩增，得到BmERR基因CDS片段；酶切回收含有增强子
‑
全身性表达启动子和终止子的质粒，并与回收得到的BmERR基因CDS片段利用同源重组的方法进行连接，构成含有增强子
‑
全身性表达启动子
‑
家蚕BmERR基因CDS
‑
终止子的重组载体；C、显微注射载体的制备采用同源重组引物，以含有增强子
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：赵萍，吴金鑫，刘碟，冯钰婷，沈关望，
申请(专利权)人：西部重庆科学城种质创制大科学中心，
类型：发明
国别省市：