一种β-胡萝卜素合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
胡萝卜素合酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及β
‑
胡萝卜素合酶突变体及其应用，更具体涉及β
‑
胡萝卜素的生物合成方面的应用。

技术介绍

[0002]β
‑
胡萝卜素属于类胡萝卜素家族，存在于植物、水果和微生物中，它可以作为维生素原、功能性化妆品、食品着色剂和饲料补充剂，因此被广泛应用于制药、保健品、化妆品和食品工业等领域，是一类具有重要生物功能和商业价值的色素。
[0003]目前，β
‑
胡萝卜素主要通过化学合成得到，但考虑到化学品的安全合成问题，以及消费者对天然添加剂、微生物的偏好，利用微生物异源表达合成β
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胡萝卜素受到越来越多的关注。
[0004]β
‑
胡萝卜素合酶是影响β
‑
胡萝卜素生物合成的关键因素之一。当前挖掘的β
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胡萝卜素合酶催化活性低，使β
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胡萝卜素微生物合成的应用受到限制。因此，优良β
‑
胡萝卜素合酶获得将对推进β
‑
胡萝卜素生物合成具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种β
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胡萝卜素合酶突变体及其应用，以解决现有技术中的β
‑
胡萝卜素合酶活性低的问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种β
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>胡萝卜素合酶突变体，所述β
‑
胡萝卜素合酶突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基础上发生如下氨基酸突变之一：V428A、Y554A、D409A、D329A、I123A、W188A、N227A、R239A、F303A、K343A、T361A、F387A、K400A、Q418A、I439A、N471A、L465A、E495A、E468A、Y406A、Y406D、Y406E、Y406F、Y406G、Y406H、Y406K、Y406L、Y406M、Y406P、Y406Q、Y406R、Y406S、Y406T、Y406V、Y406W、Y406C、Y406I、Y406N、E468D、E468F、E468G、E468H、E468K、E468L、E468M、E468P、E468Q、E468R、E468S、E468T、E468V、E468N、E468Y、E468C、E468I、E468W、F303D、F303E、F303G、F303H、F303K、F303L、F303M、F303P、F303Q、F303R、F303S、F303N、F303V、F303W、F303Y、F303C、F303I、F303T、N471D、N471E、N471F、N471G、N471H、N471K、N471L、N471M、N471P、N471Q、N471R、N471S、N471V、N471W、N471T、N471C、N471I、N471Y、Y406S+N471M、Y406S+F303C、E468M+N471M、F303C+Y406I、F303C+E468I、Y406L+N471G、Y406L+E468H。
[0007]本申请筛选到的上述突变体经过了大量的实验验证，最终证明了该酶催化反应的催化活性显著提高。其中，在一种优选的实施例中，突变体在25℃至35℃的温度下均具有较高的催化活性。在一种优选的实施例中，突变体在100~800rpm的转速下均具有较高的催化活性。
[0008]本专利技术还提供编码上述β
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胡萝卜素合酶的核酸。
[0009]本专利技术还提供表达上述β
‑
胡萝卜素合酶的基因工程细胞，其包含编码所述β
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胡萝卜素合酶的核酸。
[0010]根据本专利技术的实施方案，所述基因工程细胞是将所述核酸构建表达框，再导入宿主细胞中得到的重组菌株。
[0011]本专利技术也提供了一种产β
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胡萝卜素的重组解脂耶式酵母的构建方法，包括：将β
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胡萝卜素合酶基因导入解脂耶式酵母，得到产β
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胡萝卜素的重组解脂耶式酵母。例如，所述解脂耶式酵母为能够积累β
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胡萝卜素合成前体香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的解脂耶式酵母。
[0012]本专利技术进而提供了一种生产β
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胡萝卜素的方法，包括培养上述重组解脂耶式酵母，得到发酵产物β
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胡萝卜素。
[0013]所述培养的温度为25℃至35℃；培养时间为24h至96h；优选地所述培养在搅拌或振荡条件下进行，更优选地震荡转速为250 rpm。
[0014]进一步还包括萃取所述β
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胡萝卜素的步骤，萃取时向体系中添加萃取剂；萃取剂选自二甲基亚砜和甲醇；优选地所述萃取剂二甲基亚砜的添加含量为1 ml每100微升发酵液，甲醇的添加含量为0.5 ml每100微升发酵液；更优选地于50℃孵育1 h。
[0015]本专利技术通过在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基础上经过理性设计和酶进化筛选得到的β
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胡萝卜素合酶突变体，相比野生型β
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胡萝卜素合酶发生了蛋白质结构和功能的改变，在实际应用时，β
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胡萝卜素合酶突变体的催化效率明显提高，可获得更高的β
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胡萝卜素合成速率，因而获得更高的β
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胡萝卜素产量。同时，进一步地通过对解脂耶式酵母中MVA途径进行强化并导入β
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胡萝卜素合酶基因，构建出更加高产β
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胡萝卜素的重组解脂耶式酵母；为β
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胡萝卜素的生物合成方面提供有力酶及菌株，对于β
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胡萝卜素的生产具有重要意义。
附图说明
[0016]图1是酶底物附近氨基酸丙氨酸突变对β
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胡萝卜素合成的影响图。
[0017]图2是β
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胡萝卜素合酶关键位点组合突变对β
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胡萝卜素合成的影响图。
具体实施方式
[0018]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本专利技术。
[0019]下面结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
[0020]其中，SEQ ID NO：1的氨基酸序列（来源于Blakeslea trispora）如下：MLLTYMEVHLYYTLPVLGVLSWLSRPYYTATDALKFKFLTLVAFTTASAWDNYIVYHKAWSYCPTCVTAVIGYVPLEEYMFFIIMTLLTVAFTNLVMRWHLHSFFIRPETPVMQSVLVRLVPITALLITAYKAWHLAVPGKPLFYGSCILWYACPVLALLWFGAGEYMMRRPLAVLVSIAL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
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胡萝卜素合酶突变体，其特征在于，所述β
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胡萝卜素合酶突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基础上发生如下氨基酸突变之一：V428A、Y554A、D409A、D329A、I123A、W188A、N227A、R239A、F303A、K343A、T361A、F387A、K400A、Q418A、I439A、N471A、L465A、E495A、E468A、Y406A、Y406D、Y406E、Y406F、Y406G、Y406H、Y406K、Y406L、Y406M、Y406P、Y406Q、Y406R、Y406S、Y406T、Y406V、Y406W、Y406C、Y406I、Y406N、E468D、E468F、E468G、E468H、E468K、E468L、E468M、E468P、E468Q、E468R、E468S、E468T、E468V、E468N、E468Y、E468C、E468I、E468W、F303D、F303E、F303G、F303H、F303K、F303L、F303M、F303P、F303Q、F303R、F303S、F303N、F303V、F303W、F303Y、F303C、F303I、F303T、N471D、N471E、N471F、N471G、N471H、N471K、N471L、N471M、N4...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴宗杰，单璐，张媛媛，王钦宏，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：