一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法技术

本发明专利技术提供一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法，涉及病毒抗体检测技术领域。该新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法，将新型鸭呼肠孤病毒结构蛋白σC和非结构蛋白p18重组蛋白的高抗原指数区域作为包被抗原。本发明专利技术检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA讲的方法能够提高新型鸭呼肠孤病毒抗体检测技术的灵敏度与特异性。该方法还能够提高检测效率和提高早期诊断出新型鸭呼肠孤病毒感染，大大提高了其检测的特异性和灵敏性，对于其他常见的水禽病毒没有交叉反应，具有良好的特异性。具有良好的特异性。具有良好的特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法


[0001]本专利技术涉及病毒抗体检测
，具体为一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法。

技术介绍

[0002]禽呼肠孤病毒属于呼肠孤病科正呼肠孤病毒属，可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。鸭呼肠孤病毒病是由鸭呼肠孤病毒引起的番鸭、半番鸭、肉鸭、麻鸭和鹅等水禽的一种急性传染病，可以分为番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒两种基因型。NDRV可以感染番鸭、半番鸭、肉鸭和鹅等多种水禽，引起番鸭“出血性坏死性肝炎”（也称为番鸭“新肝病”）和肉鸭“脾坏死症”。NDRV自然感染引起的死亡率较低，发病鸭耐过后成为僵鸭；并发感染时的发病率和死亡率升高，还可以引起免疫抑制和生长发育障碍，现已成为危害水禽养殖的重要传染病之一。
[0003]目前现有的新型鸭呼肠孤病毒抗体的检测技术主要是针对σC蛋白，作为抗原蛋白包被并建立间接ELISA检测方法；且现有检测技术在该病毒的抗体检测上的灵敏度与特异性上面并不是非常的理想，存在灵敏度不高，特异性不强的问题，也不能及时在早期诊断出该病毒的感染。

技术实现思路

[0004]（一）解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法，能够提高现有的新型鸭呼肠孤病毒抗体检测技术的灵敏度与特异性；同时能够早期诊断出新型鸭呼肠孤病毒感染。
[0005]（二）技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法，包括以下步骤：步骤一：抗原制备，利用原核系统表达纯化得到具有高抗原指数区的新型鸭呼肠孤病毒的σC与p18重组蛋白；步骤二：抗原包被，以pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将p18和σC稀释至5μg/mL浓度，100 μL/孔，37孵育4h，弃封闭液，用含有0.05%吐温
‑
20的PBST洗板3次，每次静置5 min，最后一次彻底甩净拍干；步骤三：封闭，用含5% BSA的PBS作为封闭剂加入酶标板内，220 μL/孔，37℃孵育1.5h，弃封闭液，PBST洗板3次，每次静置5 min，最后一次彻底甩净拍干；步骤四：孵育一抗，待检血清用5%BSA的PBS稀释至1:200加入酶标板内，100 μL/孔，37℃孵育1 h，弃液体，洗板5次，每次静置5 min，最后一次彻底甩净拍干；步骤五：孵育二抗，使用5% BSA的PBS稀释偶联HRP的羊抗鸭IgG至1:800，100 μL/孔，37℃孵育1.5h，弃液体，洗板5次，每次静置5 min，最后一次彻底甩净拍干；
步骤六：显色，加入TMB显色剂100 μL/孔，室温避光显色15min；步骤七：终止显色，加入50μL的2 M硫酸终止反应；步骤八：测定吸光值，在酶标仪下测定OD
450nm
值。
[0006]综上所述：选取新型鸭呼肠孤病毒的两个目的抗原蛋白σC与p18，经过原核表达两种蛋白，纯化以后，通过复性成功获得可溶的目的抗原蛋白。将两种抗原蛋白联合包被于ELISA吸附板孔中，使用新型鸭呼肠孤病毒的阳性血清作为一抗，HRP标记羊抗鸭作为二抗，优化ELISA各反应条件后成功建立新型鸭呼肠孤病毒的间接ELISA检测方法。主要优化反应条件为：σC与p18抗原蛋白的各自最佳包被浓度（σC与p18各5ug/ml）、联合包被时最佳一抗与二抗的稀释浓度确定（一抗稀释度为1:200、二抗稀释度为1：800）、联合包被的最佳封闭液与封闭时间条件的确定（封闭液为5％BSA、封闭时间为2h）、联合包被时最佳一抗与二抗孵育时间的确定（一抗为1h、二抗为1.5h）、抗原蛋白包被温度与包被时间的确定（包被温度为37℃，包被时间为4h）。
[0007]（三）有益效果本专利技术提供了一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法。具备以下有益效果：1、与现有的单一σC蛋白抗原包被，其结果无论在灵敏度与特异性上都有提高。
[0008]2、本方法创新性的将p18作为联合包被抗原蛋白，p18蛋白是新型鸭呼肠孤病毒所特有的蛋白，这就大大提高了其检测的特异性，对于其他常见的水禽病毒没有交叉反应，具有良好的特异性。
[0009]3、于病毒感染的早期时，相比于其他抗体检测方法，能够起到早期诊断的作用，大大预防病毒的扩散与传播。
附图说明
[0010]图1为本专利技术的流程示意图；图2
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1和图2
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2为AlphaFold2和DNASTAR分析抗原指数图；图3为σC蛋白的SDS
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PAGE分析图；图4为p18蛋白的SDS
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PAGE分析图；图5为重组蛋白的Western blot检测鉴定图。
具体实施方式
[0011]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0012]从疑似新型鸭呼肠孤病毒病的病鸭脏器组织中，成功分离得到一株NDRV毒株。对该毒株的S1、M1、L1基因与其他呼肠孤病毒的基因进行序列分析，结果表明该毒株与目前NDRV流行毒株SY相近，其结构蛋白σC和非结构蛋白p18相似度为100%。以此病毒为模板进行目的基因σC和p18的高抗原指数区进行扩增，如图2
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1和2
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2（图2
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1代表蛋白σC，图2
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2代表p18蛋白），并将目的克隆至pET30a载体，引入如表下表。
[0013]引物设计利用基因工程菌BL21（DE3）表达目的基因，通过镍亲和层析法获得目的蛋白，结果如图3和4。分别将σC和p18用IPTG诱导表达、纯化后用SDS
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PAGE电泳后进行表达鉴定。其中，图3中：M：蛋白Maker：1：pET
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30a空白载体对照；2：pET
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30a
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σC未诱导菌液；3：诱导菌液破碎后上清；4：诱导菌液破碎后沉淀；5：σC纯化蛋白；图4中：M：蛋白Maker；1：pET
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30a空白载体对照；2：pET
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30a
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p18未诱导菌液；3：诱导菌液破碎后上清；4：诱导菌液破碎后沉淀；5：p18纯化蛋白。
[0014]将σC与p18蛋白分别经过SDS
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PAGE电泳后，转印至PVC膜上，结果表明目的蛋白σC与p18与NDRV的阳性血清发生特异性的结合与NDRV阴性血清不发生结合，如图5。
[0015]实施例一：如图1所示，本专利技术实施例提供一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法，包括以下步骤：步骤一：抗原制备，利用原核系统表达纯化得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的双抗原间接ELISA检测方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：抗原制备，利用原核系统表达纯化得到具有高抗原指数区的新型鸭呼肠孤病毒的σC与p18重组蛋白；步骤二：抗原包被，以pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将p18和σC稀释至5μg/mL浓度，100 μL/孔，37孵育4h，弃封闭液，用含有0.05%吐温
‑
20的PBST洗板3次，每次静置5 min，最后一次彻底甩净拍干；步骤三：封闭，用含5% BSA的PBS作为封闭剂加入酶标板内，220 μL/孔，37℃孵育1.5h，弃封闭液，PBST洗板3次，每次静置5 min，最后...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢会鹏，陈新凯，朱善元，吴植，王安平，吴双，周末，朱睿，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：