【技术实现步骤摘要】
一种重组人溶菌酶的纯化制备方法
[0001]本公开涉及重组人溶菌酶纯化
,具体涉及一种重组人溶菌酶的纯化制备方法
。
技术介绍
[0002]人源溶菌酶属于
C
型溶菌酶,是一种由
130
个氨基酸组成的分子量约为
14.7kDa
的单体蛋白,是一种能够溶解革兰氏阳性细菌细胞壁的酶,水解细菌中黏多糖的碱性酶
。
溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的
N
‑
乙酰胞壁酸和
N
‑
乙酰氨基葡萄糖之间的
β
‑
1,4
糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解
。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与
DNA、RNA、
脱辅基蛋白形成复合体,使病毒失活
。
[0003]溶菌酶是一种天然
、
安全性能良好的杀菌剂和防腐剂,具有抗菌
、
消炎
、
抗病毒等作用,可广泛应用于食品生物防腐
、
医药
、
日用化工等行业
。
构建重组人溶菌酶,可以大幅度提高溶菌酶活性,并且纯化得到的酶产物残留少,纯度高,具有环保
、
不受原料限制等优点
。
[0004]然而目前依然缺少高效表达有活性的人溶菌酶的工程菌,商品化的重组人溶菌酶还很少
。
[0005]需要
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
一种重组人溶菌酶的纯化制备方法,其特征在于,包括:人溶菌酶载体
pET
‑
28a(+)
通过转化大肠杆菌感受态细胞转入大肠杆菌中,对大肠杆菌进行转化并诱导表达,得湿菌;对所述湿菌进行裂解,得包涵体;对所述包涵体进行复性
、
纯化,得重组人溶菌酶
。2.
根据权利要求1所述的重组人溶菌酶的纯化制备方法,其特征在于,步骤对所述包涵体进行复性
、
纯化,得重组人溶菌酶包括:对包涵体变性后进一步进行复性,得到复性液;透析过液所述复性液,并将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化,得到纯度
≥95
%的重组人溶菌酶
。3.
根据权利要求2所述的重组人溶菌酶的纯化制备方法,其特征在于,步骤透析过液所述复性液,并将透析过液后的复性液进行离子交换层析纯化中,采用洗涤缓冲液对复性液进行离子交换层析纯化;所述洗涤缓冲液包括:
20mM Tris、2M
尿素
、0.15M
氯化钠
、20
%蔗糖;洗涤缓冲液的
pH
=
8.0
~
8.5。4.
根据权利要求1所述的重组人溶菌酶的纯化制备方法,其特征在于,按1:
5(m
:
v)
的比例向所述包涵体内加变性溶液,搅拌后取上清液,得变性液;将所述变性液滴加至复性溶液中,使得复性溶液的浓度范围为:
0.1
‑
0.3mg/ml
为止,得复性液;对所述复性液进行多次透析,并对透析后的复性液进行阳离子交换纯化,得纯度
≥99
%的重组人溶菌酶
。5.
根据权利要求4所述的重组人溶菌酶的纯化制备方法,其特征在于,所述变性溶液包括:
20mM Tris、8M
尿素
、10mM DTT
;
pH
=
8.0
~
8.5
;所述复性溶液包括:
20mM Tris、1M L
‑
精氨酸
、0.1mM GSSG、1mM GSH
;
pH
=
8.0
~
8.5
;步骤对所述复性液进行多次透析中,使用透析缓冲液对复性液进行多次透析;所述透析缓冲液为
20mM Tris
,
pH
=
8.0
~
8.5。6.
根据权利要求4所述的重组人溶菌酶的纯化制备方法,其特征在于,步骤对透析后的复性液进行阳离子交换纯化包括:采用离子交换缓冲液
A
平衡柱子,上样后清洗
、
离子交换缓冲液
B
洗脱
、
收集洗脱峰;其中,离子交换缓冲液
A
为
20mM Tris
,
p...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵江峰,李艳霞,孟苗,张江凡,张彤彤,杨小静,窦当当,黄溶,龚世位,
申请(专利权)人:西安麦博泰克生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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