一种破骨细胞Spp1基因删除的转基因小鼠模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，提供了一种体内清除SPP1蛋白制剂在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。通过中和抗体清除全身SPP1蛋白，本发明专利技术显著延缓了骨肿瘤动物模型中肿瘤生长，并验证了通过清除SPP1蛋白可以达到预防和治疗骨肿瘤的效果。本发明专利技术还提供了一种新的转基因小鼠模型，利用Cre

【技术实现步骤摘要】
一种破骨细胞Spp1基因删除的转基因小鼠模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种破骨细胞Spp1基因删除的转基因小鼠模型的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]SPP1为分泌型焦磷酸蛋白1，是一种具有多种功能的分泌型酸性糖蛋白，最初从矿化的骨基质中分离，参与骨代谢，可介导骨组织细胞与骨基质的连接，又称骨桥素蛋白。在多种组织损伤修复过程中SPP1含量增加，在使用皮肤切口模型同时敲除Spp1基因的小鼠中，观察到基质解体和胶原纤维的直径减小，切口无法得到修复，提示SPP1在创伤修复过程中发挥作用。相似的，在梗阻性肾病后的肾间质纤维化进程中，SPP1也发挥了关键性作用。在心肌梗死的模型中，Spp1基因水平及蛋白水平均出现升高，同时敲除Spp1基因后可见纤维化水平显著下降，说明SPP1参与了心肌纤维化的形成过程。因此，SPP1不仅仅是一个细胞外基质因子，同时也是一个细胞因子，在多种细胞类型中表达，并发挥多种不同功能。清除SPP1蛋白对骨肿瘤的影响尚未见相关报道。

技术实现思路

[0003]为填充现有研究领域中的空白，本专利技术提供一种清除SPP1蛋白在治疗骨肿瘤中的应用，进而阐明清除SPP1蛋白对骨肿瘤的治疗效果。
[0004]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005]本专利技术提供了体内清除SPP1蛋白的制剂在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。
[0006]优选的，所述体内清除SPP1蛋白制剂包括α
‑
SPP1抗体。<br/>[0007]本专利技术提供了一种利用Cre
‑
loxP方法阻断破骨细胞分泌SPP1蛋白的转基因小鼠模型的方法，包括以下步骤：
[0008]将携带Cre工具鼠与SPP1
floxed
小鼠进行杂交，得到Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/
‑
双基因小鼠；
[0009]将Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/
‑
双基因小鼠与SPP1
flox+/+
小鼠和/或SPP1
flox+/
‑
小鼠进行杂交，得到Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/+
双基因小鼠。
[0010]优选的，所述SPP1
floxed
小鼠包括SPP1
flox+/+
小鼠和/或SPP1
flox+/
‑
小鼠；所述携带Cre工具鼠包括Ctsk
Cre+/
‑
小鼠和/或Ctsk
Cre+/+
小鼠。
[0011]优选的，所述杂交后进行筛选，得到相应基因型小鼠；所述筛选的方法包括对小鼠进行PCR鉴定；用于PCR鉴定的特异性引物包括：用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物和用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物。
[0012]优选的，用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物包括：第一引物对和第二引物对；
[0013]所述第一引物对包括上游引物P1和下游引物P2；
[0014]所述上游引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0015]所述第二引物对包括上游引物P3和下游引物P4；
[0016]所述上游引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0017]优选的，用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物包括第三引物对；
[0018]所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述第三引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0019]优选的，若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第二引物对扩增出条带，第一引物对未扩增出条带，则含有Ctsk
Cre+/+
基因；
[0020]若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第一引物对和第二引物对均扩增出条带，则含有Ctsk
Cre+/
‑
基因；
[0021]若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第一引物对扩增出条带，第二引物对未扩增出条带，则含有Ctsk
Cre
‑
/
‑
基因；
[0022]若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度仅为375bp条带，则含有SPP1
flox+/+
基因；
[0023]若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度一条为375bp，一条为313bp，则含有SPP1
flox+/
‑
基因；
[0024]若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度仅为313bp，则含有SPP1
flox
‑
/
‑
基因。
[0025]本专利技术提供了上述技术方案所述构建方法在构建清除破骨细胞SPP1蛋白的转基因小鼠模型中的应用。
[0026]本专利技术还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的骨肿瘤模型在SPP1蛋白清除后评价抗骨肿瘤治疗效果中的应用。
[0027]本专利技术的有益效果：
[0028]本专利技术提供了体内清除SPP1蛋白制剂在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。本专利技术通过向骨肿瘤小鼠模型中注射SPP1蛋白抗体，以清除SPP1蛋白，进一步达到了显著延缓骨肿瘤动物模型中肿瘤生长的目的，进而验证了通过清除SPP1蛋白可以达到治疗骨肿瘤的效果。
[0029]进一步地，在中和抗体的基础上，本专利技术提供了一种利用Cre
‑
loxP方法构建阻断破骨细胞分泌SPP1蛋白的转基因小鼠模型的方法，包括以下步骤：将携带Cre工具鼠与SPP1
floxed
小鼠进行杂交，得到Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/
‑
双基因小鼠；将Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/
‑
双基因小鼠与SPP1
flox+/+
小鼠和/或SPP1
flox+/
‑
小鼠进行杂交，得到Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/+
双基因小鼠。
[0030]本专利技术通过特异性敲除破骨细胞中Spp1基因获得破骨细胞SPP1蛋白清除的转基因小鼠模型，进而可以通过建立骨肿瘤小鼠模型，模拟临床骨转移的实际情况，旨在阐明骨肿瘤中破骨细胞异常分泌的SPP1蛋白对骨肿瘤的发生、发展及远处转移的影响，为骨转移基础研究提供理想的动物模型，为临床骨转移治疗提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.体内清除SPP1蛋白的制剂在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述体内清除SPP1蛋白制剂包括α
‑
SPP1抗体。3.一种利用Cre
‑
loxP方法构建阻断破骨细胞分泌SPP1蛋白的转基因小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：将携带Cre工具鼠与SPP1
floxed
小鼠进行杂交，得到Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/
‑
双基因小鼠；将Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/
‑
双基因小鼠与SPP1
flox+/+
小鼠和/或SPP1
flox+/
‑
小鼠进行杂交，得到Ctsk
Cre+/
‑
SPP1
flox+/+
双基因小鼠。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述SPP1
floxed
小鼠包括SPP1
flox+/+
小鼠和/或SPP1
flox+/
‑
小鼠；所述携带Cre工具鼠包括Ctsk
Cre+/
‑
小鼠和/或Ctsk
Cre+/+
小鼠。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述杂交后进行筛选，得到相应基因型小鼠；所述筛选的方法包括对小鼠进行PCR鉴定；用于PCR鉴定的特异性引物包括：用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物和用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物包括：第一引物对和第二引物对；所述第一引物对包括上游引物P1和下游引物P2；所述上游引物P1...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱波，成佳楠，杨涛，贾罄竹，丁小芳，张译文，徐守侠，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：