基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，包括，确定用于蛋白表达的植物宿主；根据植物宿主进行基因编辑设计；构建基因编辑载体并转化；筛选并验证基因编辑效果；分析蛋白质的表达和性质。本发明专利技术植物具有良好的生长特性和较低的生产成本，通过基因编辑，可以使植物细胞有效地合成和表达高活性低毒素三型胶原蛋白，从而实现大规模高效生产，基于植物的生产平台有助于避免可能存在于其他生产系统中的动物源性病原体污染的风险，植物基因编辑方法可以设计和优化蛋白质序列，减少潜在的毒性，植物生产系统不依赖于动物资源，有助于推动生物制药和生物医学领域的可持续发展，降低对动物的依赖。降低对动物的依赖。降低对动物的依赖。

【技术实现步骤摘要】
基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别是基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法。

技术介绍

[0002]目前，胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，是结缔组织的主要组成成分，三型胶原蛋白是一种间质胶原，它是皮肤、血管等组织的主要纤维蛋白成分之一，三型胶原蛋白在哺乳动物体内多以富有弹性的薄纤维层的形式与一型胶原形成纤维组织，三型胶原蛋白在人体创伤愈合、组织修复中发挥重要作用，在皮肤修复敷料中有良好的应用效果，三型胶原蛋白呈现出独特的三螺旋结构，三螺旋结构是三型胶原蛋白具有良好生物功能的关键因素，因此，从动物组织中提取三型胶原蛋白的关键，是在保证其纯度的前提下，在提取过程中保持三型胶原蛋白的结构完整性，防止其发生变性，同时，作为医用材料的三型胶原蛋白，对于纯度和安全性均有严格的要求，对胶原蛋白中含有的内毒素等成分含量也设置了严格的行业标准，因此，需要一种创新的方法来获取高活性低毒性的三型胶原蛋白，基因编辑技术，特别是C2c2编辑技术，可以用于有针对性地修改生物体的基因组，通过将C2c2技术应用于植物细胞，可以实现对蛋白质基因的编辑，从而创造出符合需求的三型胶原蛋白。

技术实现思路

[0003]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。r/>[0004]鉴于上述和/或现有的基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法中存在的问题，提出了本专利技术。
[0005]因此，本专利技术所要解决的问题在于如何提供一种基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术实施例提供了一种基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其包括，确定用于蛋白表达的植物宿主；根据植物宿主进行基因编辑设计；构建基因编辑载体并转化；筛选并验证基因编辑效果；分析蛋白质的表达和性质。
[0008]作为本专利技术所述基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述确定用于蛋白表达的植物宿主具体包括，烟草作为是一种具有高效的蛋白表达能力，适合快速产生大量蛋白质，且蛋白表达量高、易于操作、叶片较大，适合采集蛋白质材料，适合作为植物宿主。
[0009]作为本专利技术所述基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述根据植物宿主进行基因编辑设计具体包括，选择包含三型胶原道白编
码区域的目标基因，编码区域包括外显子序列，通过C2c2设计单导RNA，确定目标序列中是与C2c2相匹配的PAM序列，单导RNA序列包括一个直接重复序列和一个反向重复序列，这两个序列将分别与目标DNA序列的不同部分配对，确保设计的单导RNA序列在这两个重复序列中具有足够的互补性，将剪切位点设计得接近目标序列的起始部分，以减少无意义的编辑。
[0010]作为本专利技术所述基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述构建基因编辑载体并转化具体包括，将C2c2的编码序列插入载体的适当位点，在载体中插入单导RNA序列，确保单导RNA的序列正确，并在其周围添加适当的序列，以促进其在细胞中的表达和识别，添加抗生素抗性基因选择标记，以便在细胞转化后筛选成功转化的细胞，在构建完基因编辑载体后，进行测序验证，确保编辑工具和单导RNA序列的正确性，准备要进行转化的目标细胞，提前优化细胞培养条件，以确保细胞处于最佳状态，选择电穿孔法，进行细胞转化。
[0011]作为本专利技术所述基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述筛选并验证基因编辑效果具体包括，编辑载体中添加了抗生素抗性基因，在培养基中加入相应的抗生素，以筛选转化或编辑成功的细胞，使用基因组测序技术验证编辑效果，比对编辑细胞的DNA序列与野生型序列，检测是否发生了预期的突变，设计引物扩增编辑区域，然后通过PCR分析产物，以检测突变或插入的存在，如果发生了编辑，PCR产物有不同的大小，使用T7E1或其他核酸酶来检测DNA杂交体是否含有不匹配碱基，从而间接检测编辑效果，在编辑细胞中测序单导RNA目标区域，以验证单导RNA是否成功引导了编辑。
[0012]作为本专利技术所述基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述分析蛋白质的表达和性质具体包括，提取编辑细胞的蛋白质，使用SDS
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PAGE将蛋白质分离，然后通过免疫印迹检测特定蛋白质的表达水平，检测显示蛋白质的活性较高；使用MTT试剂法，评估编辑后的胶原蛋白对细胞的毒性，在小鼠模型中进行毒性评估，通过皮下注射或其他途径将编辑后的胶原蛋白注入小鼠体内，监测其对动物的影响，结果显示小鼠的活动均正常，其与毒性相关检测均显示低毒素，在预测范围内；尝试在不同浓度下对编辑后的胶原蛋白进行测试，评估其在不同浓度下的毒性和效应，对于经过改进的编辑后产物，进行长期评估，观察编辑后产物的持久性效果和潜在的长期毒性。
[0013]本专利技术有益效果为：本专利技术提供一种基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，植物具有良好的生长特性和较低的生产成本，通过基因编辑，可以使植物细胞有效地合成和表达高活性低毒素三型胶原蛋白，从而实现大规模高效生产，基于植物的生产平台有助于避免可能存在于其他生产系统中的动物源性病原体污染的风险，植物基因编辑方法可以设计和优化蛋白质序列，减少潜在的毒性，植物基因编辑相对于传统蛋白质生产方法，如细胞培养或动物生产，成本更低，这有助于将高活低毒素三型胶原蛋白的生产成本降低，使其更加可负担，植物生产系统不依赖于动物资源，有助于推动生物制药和生物医学领域的可持续发展，降低对动物的依赖。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本
领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0015]图1为基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的流程图。
具体实施方式
[0016]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术的保护的范围。
[0017]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：包括，确定用于蛋白表达的植物宿主；根据植物宿主进行基因编辑设计；构建基因编辑载体并转化；筛选并验证基因编辑效果；分析蛋白质的表达和性质。2.如权利要求1所述的基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述确定用于蛋白表达的植物宿主具体包括，烟草作为是一种具有高效的蛋白表达能力，适合快速产生大量蛋白质，且蛋白表达量高、易于操作、叶片较大，适合采集蛋白质材料，适合作为植物宿主。3.如权利要求1所述的基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述根据植物宿主进行基因编辑设计具体包括，选择包含三型胶原道白编码区域的目标基因，编码区域包括外显子序列，通过C2c2设计单导RNA，确定目标序列中是与C2c2相匹配的PAM序列，单导RNA序列包括一个直接重复序列和一个反向重复序列，这两个序列将分别与目标DNA序列的不同部分配对，确保设计的单导RNA序列在这两个重复序列中具有足够的互补性，将剪切位点设计得接近目标序列的起始部分，以减少无意义的编辑。4.如权利要求1所述的基于植物基因编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述构建基因编辑载体并转化具体包括，将C2c2的编码序列插入载体的适当位点，在载体中插入单导RNA序列，确保单导RNA的序列正确，并在其周围添加适当的序列，以促进其在细胞中的表达和识别，添加抗生素抗性基因选择标记，以便在细胞转化后筛选成功转化的细胞，在构建完基因编辑载体后，进行测序验证，确保编辑工具和单导RNA序列的正确...

【专利技术属性】
技术研发人员：史海明，
申请(专利权)人：水剥离上海医疗美容有限公司，
类型：发明
国别省市：