一种结核病诊断用可变剪接标志物制造技术

本发明专利技术属于标志物筛选技术领域，公开了一种结核病诊断用可变剪接标志物

【技术实现步骤摘要】
一种结核病诊断用可变剪接标志物、筛选方法及应用


[0001]本专利技术属于标志物筛选
，尤其涉及一种结核病诊断用可变剪接标志物
、
筛选方法及应用
。

技术介绍

[0002]目前，结核病发病率高，关键在于早期诊断
。
临床上结核病的诊断方式主要依赖于病原学检测和基于宿主免疫反应的检测
。
前者主要指涂片
、
培养等，而其中培养是结核病诊断的金标准，但该种诊断方式的敏感度有限，受取样影响大
。
基于宿主免疫反应的检测如
γ
干扰素释放试验等，也为结核病的诊断提供了重要的实验室证据，但其对免疫缺陷人群的适用性有限
。
根据世界卫生组织最新统计数据显示，目前仅有
58
％的患者有实验室证据，提示现有诊断能力无法满足实验室要求，亟需开发新的标志物
。
[0003]宿主来源的转录组标志物被证实能够反映结核病的发生发展，并且检测成本低，周期短，是广受关注的结核病新型标志物
。
现有转录组标志物主要基于“表达量变化”进行筛选，忽略了基因内部异质性带来的影响
。
可变剪接将一个基因视为多个不同的转录本，能够反映不同转录本组成
、
转录本表达及上述转录本之间比例的变化
。
这表明可变剪接能够从多角度反映结核病的发生发展，具有作为高敏感度标志物的特性
。
[0004]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：结核病缺乏有效的诊断标志物，而传统转录组标志物主忽略了基因内部异质性带来的影响，导致其对结核病诊断效能不理想
。
[0005](1)
目前的结核病诊断方式主要包括病原学检测和基于宿主免疫反应的检测
。
病原学检测，如涂片和培养，虽然是金标准，但是其敏感度有限，且受取样质量的影响较大
。
基于宿主免疫反应的检测，如
γ
干扰素释放试验，对免疫缺陷人群的适用性有限
。
这表明当前的诊断方法无法满足实验室的需求，亟需开发新的标志物
。
[0006](2)
当前使用的转录组标志物主要基于“表达量变化”进行筛选，忽略了基因内部异质性带来的影响
。
这可能导致其对结核病的诊断效能不理想
。
[0007](3)
可变剪接将一个基因视为多个不同的转录本，能够反映不同转录本组成
、
转录本表达以及转录本之间比例的变化
。
这种多角度反映结核病的发生发展的方法有潜力成为高敏感度的结核病标志物，但目前还未被充分利用
。

技术实现思路

[0008]针对现有技术临床结核病诊断存在的敏感度和特异度不足的问题，本专利技术提供了一种结核病诊断用可变剪接标志物
、
筛选方法及应用
。
[0009]本专利技术是这样实现的，一种本专利技术实施例提供的结核病诊断用可变剪接标志物为2个可变剪接事件，
UBE2B
‑7号外显子跳跃和
KIF13B
‑4号外显子跳跃
。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供一种所述结核病诊断用可变剪接标志物的筛选方法，所述结核病诊断用可变剪接标志物的筛选方法包括以下步骤：
[0011](1)
使用
EDTA
抗凝管，采集初诊初治的结核病患者及与其年龄
、
性别匹配的健康对照者的外周全血
5ml
；
[0012](2)
血液样本采集完成后立即震荡，使抗凝剂与血液样本混合均匀；
[0013](3)
采集完成后的血液样本需2小时内进行处理：
3000rpm
离心
10
分钟，用吸管吸取白细胞层于
1.5ml EP
管中，加入红细胞裂解液，并震荡混匀，静置5‑
10
分钟，使红细胞裂解充分；
3000rpm
离心5分钟后，去除上清液后再次加入红细胞裂解液，重复上述步骤，直到沉淀变白后，加入
1ml
的
Trizol
，震荡混匀；存于
‑
80℃
冰箱备用；
[0014](4)
使用水相法提取
RNA
，使用琼脂糖凝胶电泳
、
分光光度计
、Qubit
以及
Agilent 2100
检测
RNA
纯度
、
浓度和完整性；
[0015](5)
按照牛津纳米孔测序官方操作流程进行建库和测序：取
1ug Poly A
样品和
50ug RNA
，采用
strand
‑
switch
法逆转录获取
cDNA
；使用牛津
SQK
‑
PCS109
快速扩增试剂盒和牛津
SQK
‑
PBK004
条形码试剂盒，对
cDNA
进行
PCR
扩增，并将条形码标签添加至每个样本的
cDNA
中，构建测序的文库；连接测序配适器后，使用
PromethION
平台进行测序；
[0016](6)
初步数据分析：使用
Guppy
对原始测序数据进行碱基判读，并按照序列长度
>100bp
等条件对原始序列进行过滤得到干净读长；使用
Pychopper
对全长转录本进行鉴定和方向矫正；基于
Ensembl
数据库中
hg38
的人类参考基因组序列，使用
Minimap 2
进行比对，使用
Gffcompare
进行注释；
[0017](7)
可变剪接相关数据分析：使用
SUPPA2
进行可变剪切分析，采用剪接百分比
(PSI)
来定量剪切事件；差异事件被定义为该事件在结核病组和健康对照组间的
P<0.050
；
[0018](8)
对于筛选出的目标差异事件，在大样本量的前瞻性队列
(
结核病患者和健康对照者
)
中进行验证；检测方法采用
qPCR
，其中
qPCR
检测过程中所用引物设计原则为：针对每个剪接事件分别设计2对引物以实现对包含和不包含剪接序列的转录本的检测
。
将每对引物中的一条引物放置在
junction
区，按照扩增的长度为
80
‑
160bp、
引物长度为
16
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种结核病诊断用可变剪接标志物，其特征在于，所述结核病诊断用可变剪接标志物为2个可变剪接事件，
UBE2B
‑7号外显子跳跃和
KIF13B
‑4号外显子跳跃
。2.
如权利要求1所述结核病诊断用可变剪接标志物的筛选方法，其特征在于，在
hg38
的基因版本中，
UBE2B
‑7号外显子跳跃事件涉及剪接位点的基因坐标为：5号染色体正链
134388413
‑
134388977
；
134389052
‑
134390225
；涉及剪接的序列为：
TGTCTTGCTCTGTTGCCCAGACTGGAGTGCAATGGCACAATCTTGGCT CACCGCAACCTCTGCCTCCCGGGTTCAA。3.
如权利要求1所述结核病诊断用可变剪接标志物的筛选方法，其特征在于，
KIF13B4
号外显子跳跃的涉及的基因剪接位点坐标为：8号染色体负链
29191057
‑
29196187
；
29196199
‑
29245346。
涉及的序列为：
GGGCCAGCCGAAG。4.
一种如权利要求1所述结核病诊断用可变剪接标志物的筛选方法，其特征在于，所述结核病诊断用可变剪接标志物的筛选方法包括以下步骤：采集完成后的血液样本需2小时内进行处理：
3000rpm
离心
10
分钟，用吸管吸取白细胞层于
1.5mlEP
管中，加入红细胞裂解液，并震荡混匀，静置5‑
10
分钟，使红细胞裂解充分；
3000rpm
离心5分钟后，去除上清液后再次加入红细胞裂解液，重复上述步骤，直到沉淀变白后，加入
1ml
的
Trizol
，震荡混匀；存于
‑
80℃
冰箱备用；使用水相法提取
RNA
，使用琼脂糖凝胶电泳
、
分光光度计
、Qubit
以及
Agilent2100
检测
RNA
纯度
、
浓度和完整性；按照牛津纳米孔测序官方操作流程进行建库和测序：取
1ugPolyA
样品和
50ugRNA
，采用
strand
‑
switch
法逆转录获取
cDNA
；使用牛津
SQK
‑
PCS109
快速扩增试剂盒和牛津
SQK
‑
PBK004
条形码试剂盒，对
cDNA
进行
PCR
扩增，并将条形码标签...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕梦媛，周健，应斌武，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：