实现mRNA-介导的将遗传信息转移到植物中的方法及该方法的产物技术

本发明专利技术所公开的是用于有益的植物遗传转化的方法，该方法通过ｍＲＮＡ而非ＤＮＡ介导遗传信息转移。此外还公开了表达由上述ｍＲＮＡ编码的蛋白的植物。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和遗传工程学领域。具体地说，本专利技术涉及将外源遗传物质(mRNA)引入植物的方法。参考文献本专利申请引用了多篇学术文章和科学出版物来描述本申请所涉及的现有技术。所有这些出版物均全文引入作为参考。
技术介绍
现有技术中已有改良种多种作物的方法。其中的一些涉及将外源(即非内源)DNA引入植物细胞或组织，再分析所得植物中外源核酸的存在以及外源基因的表达。尽管这些方法在某些情况下可以取得成功，但它们费时、费力并且再现性差。因此，仍然需要进一步开发有利于农作物遗传转化的方法，以提高蛋白产量或对其进行改良使之更益于人和/或动物食用。专利技术简述一方面，本专利技术提供生产转基因植物的方法，该方法通过向植物中引入外源mRNA赋予所得转基因植物在其子代中合成外源蛋白的能力。本专利技术通过mRNA分子(而非DNA分子)传递遗传信息，相对于现有技术中应用的方法具有显著的进步。应用本专利技术的方法可使植物在表达有价值的外源蛋白的同时植物内源蛋白的表达也得到有益增长。另一方面，本专利技术还包括表达有益外源蛋白的转基因植物，所述植物是通过下述步骤生产的获得编码外源蛋白的mRNA的样品，在可使mRNA进入种子的条件下，用mRNA温育并接种植物种子，使种子发芽并从种子长成转基因植物。所述的mRNA样品优选来自大豆，最优选来自大豆的子叶或芽。另外，可通过经分离的、编码所述蛋白的DNA分子转录来获得上述mRNA样品，所述DNA分子例如编码在医药方面有用的蛋白(优选人蛋白，如γ干扰素，白介素1，白介素2和人生长激素)的DNA分子。更优选地，所述植物是玉米，最优选玉米品系27-1或85089。另一方面，本专利技术包括表达大豆球蛋白、人白介素1、人白介素2或人γ干扰素的转基因植物，优选玉米。最优选地，在本专利技术的这一方面所述的玉米是品系27-1；或者是玉米品系85089。在一个实施本专利技术的示例中，从大豆子叶中分离并纯化出mRNA用于玉米种子微注射。使经处理的种子萌芽，分析所得植物中外源蛋白的表达。微注射并转化后，通过蛋白检测技术分析繁殖出的转基因玉米植株中蛋白的存在与含量。用大豆球蛋白特异的放射性标记DNA探针，通过DNA印迹证实在经转化的玉米中存在大豆DNA。在本专利技术另一个示例性的实施方案中利用的是从大豆的芽中分离出的mRNA。此外，还可以应用其他的玉米品系，如玉米品系85089。可一次、两次甚至多次将mRNA微注射到受体种子中。利用本专利技术的方法成功地生产出表达大豆球蛋白的转基因玉米植株。下面通过详细描述和实施例对本专利技术的其他特点和有益之处进行阐述。优选实施方案及已知的本专利技术最佳实施方式的详细描述为了便于理解本专利技术，提供下述定义mRNA信使核糖核酸是编码蛋白的DNA有义链的暂时性的互补拷贝。在真核生物中，这一基因表达过程中的重要中间产物是通过RNA聚合酶II从编码蛋白的基因转录而来。通常，先转录出较长的前-mRNA，然后在核内对其进行加工。而且，对于大多数真核mRNA还要通过转录后修饰加上5′帽结构和3′poly A尾。转基因植物通过重组核酸技术工程化、表达由其他植物或动物编码的外源蛋白的植物。DNA杂交实验由Edward Southern于1975年开发的一种技术，这项技术指经电泳分离的DNA片段变性后从琼脂糖凝胶上转移到覆盖在该凝胶上的硝酸纤维素或尼龙膜上，然后再使其与互补核酸探针杂交。之所以需要上述的转移步骤是因为与凝胶本身杂交效率很低。这项技术普遍应用于分子遗传学领域，其多种应用形式通常用于从限制性片段混合物中鉴定出特定的DNA序列，例如确定基因组中某基因的存在、位置和拷贝数。该项技术也可用于DNA分型。蛋白印迹一种从复杂的蛋白混合物(如细胞抽提物)中检测一种或多种特定蛋白的方法，由于该方法类似于鉴定DNA序列的DNA杂交和鉴定RNA的RNA印迹方法而得名。该方法包括通过变性SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白混合物，再由电印迹将上述混合物转移并固定到硝酸纤维素膜或尼龙固体膜上。然后将加载后的膜与针对感兴趣的蛋白的抗体一起温育。然后利用与某种酶共价连接并针对上述第一抗体的第二抗体检测在膜上如此形成的抗原-抗体复合物。利用酶反应形成的可溶性反应物指示膜上靶蛋白的位置。Ouchterlony双向琼脂免疫扩散实验在该实验中，将抗原和抗体置于琼脂糖凝胶中的孔内，两者相向扩散，在以适当比例相接触的区域沉淀形成不透明的线。包含几种抗原则的沉淀物通常产生多条线。在相邻近的孔中设置沉淀反应可用于评估抗原间的免疫关系。各抗原形成的线可能完全汇合，显示出免疫同一性。若抗原间部分相关则表现为马刺状，若形成十字交叉则表明抗原间不相关。本专利技术的方法可以从所选择的来源中分离和纯化mRNA。分离后，将mRNA单独注射到植物的种子中(例如，玉米谷粒)，然后将其种植下去并使其生长至成熟。转化后，分析所得植物子代中的蛋白含量。可通过免疫和生化方法证明经处理的植物中是否存在外源蛋白。下文中详细列出的实验数据表明，将植物或动物的mRNA微注射到玉米谷粒中可形成转基因玉米植株代，该植株中可形成由所选择的mRNA编码的蛋白。在不试图通过任何特定的解释对这一现象进行限定的情况下，这一现象表明上述的mRNA进行了反转录并整合到玉米的基因组中。因此，例如大豆mRNA产生的球蛋白在玉米的后续世代中得以表达。利用32P-标记的互补大豆球蛋白探针通过DNA印迹可以证明大豆球蛋白核酸序列的存在。本专利技术的方法可以生产转基因玉米，其中的转基因可在后续世代中稳定遗传，该方法包括下述步骤1.分离或通过其他的方法获得所需的mRNA。2.收获待遗传修饰的植物物种的种子。3.使上述种子吸液膨胀。4.将mRNA微注射到上述种子中。5.种植上述种子并使其生长至成熟。6.筛选长成的植株并从中选出含有由所需mRNA编码的蛋白的植株。第一步，通过分离或其他方法获得所需的mRNA，任何在所需植物中表达的mRNA均可用于本专利技术。本申请中以两大类mRNA为例(1)编码植物主要结构蛋白的mRNA，例如，大豆球蛋白；(2)编码具有有用的生物活性的蛋白；例如人生长激素(HGH)和人γ干扰素的mRNA。利用本专利技术的方法已引入植物的其他mRNA包括引入玉米品种85079的大豆球蛋白，人生长激素，人白介素1，β，2，人γ-干扰素；引入玉米品种27-1的大豆球蛋白；引入玉米品种340的人白介素2；引入美国甜玉米的大豆球蛋白和人γ-干扰素；引入水稻的大豆球蛋白；引入小麦的大豆球蛋白和(试验性的)鸡肌球蛋白。其他可用于本专利技术的mRNA包括但不限于人白蛋白，人尿激酶型纤溶酶激活物、水蛭素(来自水蛭的抗凝血剂)和人胸腺素-4。总之，本专利技术包括使用任何植物和动物的mRNA。用常规方法分离mRNA，如Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory)(1989)或Ausubel等(编)现代分子生物学技术(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons(2001)中所描述的方法。在一个优选实施方案中，所需的mRNA是主要的结构或贮存蛋白(如，大豆球蛋白)的mRNA，适量的mRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产表达外源蛋白的转基因植物的方法，该方法包括ａ）获得编码所述外源蛋白的ｍＲＮＡ样品；ｂ）在可使所述ｍＲＮＡ进入所述种子的条件下，将所述植物的种子和ｍＲＮＡ一起温育；ｃ）使所述的种子萌芽；和ｄ）由所述种子 长成所述转基因植物。

【技术特征摘要】
1.一种生产表达外源蛋白的转基因植物的方法，该方法包括a)获得编码所述外源蛋白的mRNA样品；b)在可使所述mRNA进入所述种子的条件下，将所述植物的种子和mRNA一起温育；c)使所述的种子萌芽；和d)由所述种子长成所述转基因植物。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的外源蛋白是大豆球蛋白。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述的外源蛋白选自人生长激素，人γ干扰素，人白介素1，人白介素β和人白介素2。4.如权利要求1所述的方法，其中所述的种子是玉米种子。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述外源蛋白利用选自下组的方法检测蛋白印迹，双向琼脂免疫扩散，和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。6.如权利要求1所述的方法，其中，通过微注射将所述mRNA引入所述种子中。7.如权利要求2所述的方法，其中，所述的mRNA是从大豆子叶或芽分离的。8.如权利要求3所述的方法，其中，mRNA是由经分离的DNA分子转录产生的。9.一种由下述方法生产的表达外源蛋白的转基因植物，该方法包括a)获得编码所述外源蛋白的mRNA样品；b)在可使所述mRNA进入所述种子的条件下，将所述植物的种子和mRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛满江，
申请(专利权)人：多种基因工程公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]