鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的引物和方法。该引物包括引物Li1

【技术实现步骤摘要】
鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的引物和方法


[0001]本专利技术涉及物种鉴别领域，具体涉及一种鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的引物和方法。

技术介绍

[0002]南美藜麦(Chenopodium quinoaWilld.)，又称藜麦，苋科藜属植物，株高1.5
‑
2.5m，原产于南美洲的安第斯山脉，具有耐旱、耐贫瘠、耐盐碱的特性，在原产地，从海平面到4000m海拔都有藜麦的分布，栽培历史已有5000年以上，因其营养全面，被FAO称作唯一能够满足人体基本营养需求的单体食物，近年来，在国内各省均有引种。藜麦籽粒颜色丰富，有黑、红、白、褐、棕、灰、黄等多种颜色，其中以黑色、白色和红色栽培较多。
[0003]台湾红藜(Chenopodium formosanumKoidz.)，又叫台湾藜，是中国台湾原生的苋科藜属植物，株高1.5
‑
2.5m，其籽粒成熟期茎秆呈紫红色，籽粒亦呈红色，籽粒颜色与红色南美藜麦相似，生长特性也与南美藜麦相似，但抗倒伏能力较南美藜麦强，耐高温和高湿，在我国东部引种较多，部分人会误将其作为藜麦的一个品种。
[0004]红心藜(Chenopodium centrorubrum(Makino)Naka)，为藜(Chenopodium album L.)的变种，枝顶幼叶密布红色粉粒，长大后逐渐变绿，在浙江庆元地区分布较广，株高近3米，杆较藜麦粗壮50％以上，强抗倒伏，在粮食匮乏时期曾作为粮食食用，籽粒黑色。
[0005]藜(Chenopodium albumL.)，又名灰灰菜，大多株高仅0.5m，人工营养栽培下可达2m，是国内常见苋科藜属野草，其幼年期，形态与藜麦、台湾红藜和红心藜相似，较难分别，但其植株较小，籽粒黑色，产量低，商业化栽培较少。
[0006]南美藜麦、台湾红藜、红心藜和藜的特性见下表：
[0007][0008]南美藜麦、台湾红藜、红心藜和藜在幼苗期不易分辨，相同颜色的种子之间也不易分辨，为物种的准确栽培应用带来了难题。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种快速鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的引物和方法，能够在幼苗期对这四个物种进行早期准确鉴定，无需等待较长的生长期，可提高作物栽培物种的准确率，降低作物误栽培所造成的经济损失，在作物栽培上具有重要的应用价值。
[0010]一种鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的引物，包括引物Li1
‑
23和引物Li2
‑
78；
[0011]所述引物Li1
‑
23：
[0012]上游引物：5
’‑
GGCATCTATAAATCTAC
‑3’
(SEQ ID NO：1)，
[0013]下游引物：5
’‑
GGCATCTATACTATCTAC
‑3’
(SEQ ID NO：2)；
[0014]所述引物Li2
‑
78：
[0015]上游引物：5
’‑
CGAAGGGTGTGTAGGCTGTATG
‑3’
(SEQ ID NO：3)，
[0016]下游引物：5
’‑
AGATGCTTTGTGCGTGTTAGTG
‑3’
(SEQ ID NO：4)。
[0017]可选的，所述引物中可引入荧光染料、荧光探针等用于荧光标记的材料设计成荧光标记引物，以适应各种荧光检测设备或荧光读取设备。一般是将所述引物中的上游引物进行荧光标记。
[0018]一种鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的方法，包括步骤：
[0019](1)提取各待测样本嫩叶的DNA；
[0020](2)分别以步骤(1)提取的各DNA作为DNA模板，采用所述引物Li1
‑
23进行PCR扩增，得到各引物Li1
‑
23PCR扩增产物；
[0021](3)将步骤(2)中各引物Li1
‑
23PCR扩增产物纯化，得到各纯化后引物Li1
‑
23PCR扩增产物；
[0022](4)分别以步骤(3)中各纯化后引物Li1
‑
23PCR扩增产物作为DNA模板，采用所述引物Li2
‑
78进行PCR扩增，得到各引物PCR扩增产物；
[0023](5)将步骤(4)中各引物PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得各待测样本的PCR扩增产物条带，根据各待测样本的PCR扩增产物条带判定其所属的物种。
[0024]步骤(5)中根据各待测样本的PCR扩增产物条带判定其所属的物种的判定标准：PCR扩增产物条带有两条且长度在610bp和540bp的是红心藜；PCR扩增产物条带仅有一条且长度在650bp的是南美藜麦；PCR扩增产物条带有两条且长度在650bp和420bp的是台湾红藜；PCR扩增产物条带仅有一条且长度在540bp的是藜。
[0025]可选的，步骤(2)中所述各引物Li1
‑
23PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得各引物Li1
‑
23PCR扩增产物条带，根据各引物Li1
‑
23PCR扩增产物条带判定其所属的物种；可作为初步判定，后续判定再结合步骤(5)中的判定结果。根据各引物Li1
‑
23PCR扩增产物条带判定其所属的物种的判定标准：引物Li1
‑
23PCR扩增产物条带有三条且长度在740bp、538bp和400bp的是红心藜；引物Li1
‑
23PCR扩增产物条带仅有一条且长度在538bp的是南美藜麦和台湾红藜；引物Li1
‑
23PCR扩增产物条带仅有一条且长度在400bp的是藜。
[0026]可选的，步骤(3)中，所述纯化采用磁珠法核酸提取。所述磁珠法核酸提取可直接采用现有用于核酸提取的磁珠，例如市售的磁珠试剂盒。
[0027]可选的，所述南美藜麦为种子是红色的南美藜麦(又称南美红藜麦、南美红藜)。
[0028]本专利技术所述鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的引物的获得方法，包括：用简
单重复序列区间(ISSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、相关序列扩增多态性(SRAP)通用引物(可任意选择)分别对红心藜、南美藜麦(例如南美红藜)、台湾红藜和藜的DNA进行分子标记PCR扩增及琼脂糖电泳检测，通过大量DNA指纹图谱比较分析，筛选红心藜、南美藜麦(例如南美红藜)、台湾红藜和藜的特异性核酸片段，随后通过割胶回收、测序，采用DNAMAN软件进行序列比对，寻找差异片段，采用primer premier软件进行引物的设计，并合成设计的引物，得到初步筛选合成的引物。以红心藜、南美藜麦(例如南美红藜)、台湾红藜和藜四种藜属植物的DNA为模板，采用PCR验证，从初步筛选合成的引物中获得鉴别红心藜、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的引物，其特征在于，包括引物Li1
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23和引物Li2
‑
78；所述引物Li1
‑
23：上游引物：5
’‑
GGCATCTATAAATCTAC
‑3’
，下游引物：5
’‑
GGCATCTATACTATCTAC
‑3’
；所述引物Li2
‑
78：上游引物：5
’‑
CGAAGGGTGTGTAGGCTGTATG
‑3’
，下游引物：5
’‑
AGATGCTTTGTGCGTGTTAGTG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物为荧光标记引物。3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述南美藜麦为南美红藜麦。4.一种鉴别红心藜、南美藜麦、台湾红藜和藜的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提取各待测样本嫩叶的DNA；(2)分别以步骤(1)提取的各DNA作为DNA模板，采用权利要求1或2所述引物Li1
‑
23进行PCR扩增，得到各引物Li1
‑
23PCR扩增产物；(3)将步骤(2)中各引物Li1
‑
23PCR扩增产物纯化，得到各纯化后引物Li1
‑
23PCR扩增产物；(4)分别以步骤(3)中各纯化后引物Li1
‑
23PCR扩增产物作为DNA模板，采用权利要求1或2所述引物Li...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴应齐，姚理武，郑世伟，姚丰平，陈奕浪，叶增新，何勇清，叶学件，吴大瑜，王衍彬，王丽玲，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：